环状RNA（circRNA）凭借其高稳定性和持久的蛋白表达能力，成为具有治疗潜力的新型分子，使体外制备（IVT）circRNA展现广阔的应用前景。目前，体外制备circRNA的化学法或连接酶法，设计简单、效率较高，尤其适用于＜500 nt的小RNA环化。对于更长序列，则广泛使用核酶介导的环化策略，例如排列内含子-外显子（PIE）法，可实现长链RNA的准确环化，且不依赖连接酶。
然而，PIE法的环化效率高度依赖于核酶的正确折叠，易受相邻复杂结构的干扰；还会残留内含子片段等副产物，必须通过复杂的纯化步骤予以去除。但常规纯化方法分离效率有限，容易导致产物损失，严重限制了circRNA的应用。因此，亟需开发能够同步简化合成与纯化过程的新型环化策略，以支持长序列circRNA的高效制备。
近日，清华大学刘冬生教授、中国科学院化学研究所董原辰研究员和中国科学院杭州医学研究所张亮研究员团队合作，在J Am Chem Soc期刊上发表研究论文：A Computationally Optimized Ribonucleic Acid Circularization Strategy without Byproducts。该研究开发了一种新型通用的RNA自环化（self-circularization）策略，显著减少副产物形成，并简化纯化流程。
该方法基于T4 RNA连接酶2（T4 Rnl2）环化法，通过计算设计优化环化基序，显著提高了环化效率和序列普适性，减少了副产物的产生，实现了数十至数千核苷酸长度RNA的稳健环化。所制备的circRNA具备优异的结构稳定性和翻译性能。这种经计算优化、无需复杂纯化的环化策略，为规模化生产circRNA及推进RNA药物开发提供了强有力的技术平台。
核心策略：自环化系统设计
研究设计的前体RNA由三个环化基序整合到目标RNA序列产生，三个环化基序分别为启动子（promoter unit）（紫色）、锁（lock unit）（红色）和钥匙（key unit）（蓝色）。启动子单元设计在RNA的5’端，可形成一个小茎环结构。锁单元位于启动子单元旁边，并与位于RNA 3’端的钥匙单元互补。通过退火过程，钥匙和锁单元的杂交使RNA的5’和3’末端接近。最终，在T4 Rnl2的催化下，前体RNA环化为环状RNA。
图1 自环化策略示意图
自环化策略验证：制备circRNA
研究采用上述策略成功环化了215 nt的RNA，环化效率达73%，而缺乏锁设计的对照RNA仅产生微量环状产物，进一步证明了该环化策略的有效性与必要性。
图2 RNA自环化结果
自环化策略优化：反应条件
为提升环化效率并推进大规模应用，团队对反应体系进行了系统优化。由于IVT产生的线性RNA携带5′‑三磷酸末端，而T4 Rnl2连接酶必需末端为5′‑单磷酸，传统方法采用apyrase水解ATP的γ-与β‑磷酸，实现末端转化，但该酶成本高昂且步骤繁琐。
为此，研究提出一种经济高效的替代方案：在IVT过程中加入5倍摩尔过量的鸟苷一磷酸（GMP），促使RNA聚合酶优先将GMP引入5′端，从而高效合成＞99%的单磷酸化RNA。该策略的效率与apyrase处理相当，显著降低了成本与操作复杂性。
团队进一步优化了包括退火缓冲液Mg²⁺浓度、反应时间及底物浓度等反应参数，在增强RNA二级结构稳定性和避免降解的同时，有效抑制二聚体生成，从而显著提高环化产率与产物纯度。
自环化策略优化：计算设计的motif
研究进一步深入分析了启动子、锁和钥匙的长度及序列对环化的影响（图3）。然后，团队制备了一系列长度74~1100 nt的RNA，并在RNA两侧添加了环化基序进行环化。74~500 nt的RNA环化效率＞70%，其中74 nt RNA达92%（图4A）。而1100 nt的RNA底物，添加6 nt的锁和钥匙可获得高环化效率（46%），突出了自环化策略的多功能性。
较长RNA的环化效率下降可能是由于二级结构的复杂性增加，阻碍了锁钥杂交。研究发现延长锁钥单元，可以增加杂交区的长度和互补性，加强锁钥之间的结合亲和力，使锁钥形成更稳定的二级结构，更低的杂交自由能，并降低与RNA底物非特异性相互作用的可能性。
为了进一步优化锁钥设计，研究使用一个自动计算程序设计了具有最大特异性和结合亲和力的9 nt锁钥对（LinRNA1100-S9）。该程序评估了序列互补性、热力学稳定性和潜在的错配目标的相互作用，以选择钥匙锁对，最大限度地减少错配，同时最大限度地提高杂交强度。经过计的LinRNA1100-S9环化效率提高至74%。
利用自动化程序为三条1569 nt RNA序列设计锁钥对，实现了62%的平均环化效率，这证明了自动化程序优化策略的稳健性和普适性。
团队表示，该策略的线性前体RNA和circRNA具有相同的序列和功能，因此不需要额外的纯化，如RNase R处理或尺寸排除层析。简单的缓冲液交换和除盐操作足以制备circRNA，这种简化的工艺大大降低了生产成本和时间，使其非常适合大规模环状RNA合成。
图3 环化motif的影响
图4 长链RNA环化工艺的优化
自环化策略制备circRNA的功能验证
利用自环化平台合成1451 nt（FNluc）和2512 nt（Fluc）的circRNA，效率分别为72%和68%。研究结果显示，相比线性mRNA，基于自环化策略的circRNA在HepG2细胞中翻译效率更高，表达持续时间更长，48小时后蛋白表达效率是线性mRNA的9.5倍；6天之后差距扩大为11.3倍。
研究进一步利用基于DLin-MC3-DMA的脂质纳米颗粒（LNP）包封FNluc，然后通过静脉注射至小鼠体内。结果表明，工程化FNluc circRNA可以在体内有效表达，而不需要进一步纯化。此外，NanoLuc在注射后至少96小时内保持强效表达，突显了其用于静脉注射mRNA疗法的潜力。
图5 基于自环化策略的circRNA在体内的表达。
总结
该研究开发了一种新型的自环化策略，使用简单的基序，高效制备circRNA，并最大限度地减少副产物的形成和复杂的纯化。该策略基于自动化计算程序的环化基序设计，实现几十到数千个核苷酸序列的稳健环化，可以产生在体外和体内具有优异稳定性和翻译效率的circRNA。该策略兼备多功能性和序列普适性，有望作为新型治疗性环状RNA设计和合成的核心技术平台，为精确医学提供创新的解决方案。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c09798