环状RNA因其稳定性和翻译潜力，被广泛认为是新一代RNA治疗的重要候选。然而，目前常用的体外合成方法往往伴随“疤痕序列”（scar），影响环化效率与功能。
2025年8月，大连理工大学林佳奇团队在 Molecular Therapy – Nucleic Acids 发表论文“Mechanistic insights into circularization via Anabaena group I intron-based scarless circular RNA”，基于 Anabaena group I intron，提出了一种“无疤痕”环化策略，并深入解析其分子机制。
研究团队利用 group I intron自剪接体系，成功构建scarless circRNA平台。相比传统T4 RNA ligase或permuted intron-exon (PIE) 系统，该策略避免了额外序列插入，显著提升环化精度，为环状RNA的应用提供新见解。
无疤痕环化设计可行但效率受限
研究团队基于 Anabaena group I 内含子，尝试通过重新设计IG序列来实现scarless circRNA环化。结果显示，优化后的设计能够获得无疤痕环状RNA并表达功能蛋白，但效率明显低于经典PIE方法。这提示scarless策略虽具可行性，但仍需进一步机制研究来提升环化效率。
图1 IG序列设计对环化效率的影响
高效无痕环化的新思路
研究表明，Anabaena group I 内含子的剪接机制依赖于结构环境与局部序列的协同作用：3′剪接位点识别主要取决于其与5′位点及邻近结构的相互作用，而非保守序列；5′剪接位点则通过IG配对和邻近同源臂的稳定作用实现精准识别。强配对可能破坏P1螺旋、降低效率，但缩短或优化同源臂可恢复甚至增强环化。该发现为构建高效、无scar的环状RNA提供了重要理论基础与优化策略。
图2 3′剪接位点的位置对剪接过程的影响
无痕环化：精准构建 circRNA
研究团队提出了 circRNA 无痕环化的设计规则，并在 IRES+Fluc 与 IRES+eGFP 上成功验证。通过合理选择剪接位点和短同源臂，circRNA 能够在不引入任何外源序列的情况下高效环化，效率与PIE法相当，并在细胞中表达功能蛋白，为精准 circRNA 设计提供了新思路。
图3 剪接位点序列特征及无痕circRNA构建的结论
环状RNA：天然低免疫原性
针对环状RNA免疫原性的争议，研究团队深入探讨了其免疫反应来源。结果显示，circRNA 本身天然低免疫原性，“scar”序列并非主要触发因素。实验进一步发现，免疫反应主要源于线性副产物，如 nicking RNA 或断裂片段。去除这些杂质后，纯化 circRNA 在细胞和小鼠体内均保持低免疫原性，同时可持续表达功能蛋白，凸显其在安全 RNA 药物开发中的潜力。
图4 疤痕对免疫原性的影响
修饰核苷酸对环状RNA的“双刃”作用
研究团队发现，在 circRNA 中掺入伪尿苷（N1-PseU）或其他修饰核苷酸可降低未纯化产品的免疫原性，但同时导致环化效率下降，并显著削弱 IRES 的翻译能力。完全替换会阻止环化，而低比例修饰虽然保留部分环化，却仍降低蛋白表达。
实验表明，修饰核苷对 circRNA 的免疫抑制作用有限，而对结构和功能的负面影响更突出，提示在 circRNA 设计中需谨慎平衡免疫性和表达效率。
图5 修饰核苷酸掺入对circRNA的影响
无痕circRNA应用新方向：分子海绵
团队应用 scarless 方法成功生成小型治疗 circRNA——circFBXW4，用于抑制结直肠癌相关 miRNA。相比传统 PIE 方法，scarless circRNA 不引入异源序列，保持天然二级结构，精准形成 miRNA 结合位点，且在细胞中降解更慢，展现出更高稳定性。
免疫原性测试表明，‘scar’ 的存在并不增加免疫反应，凸显 scarless 方法在小型治疗 circRNA 制备中的优势和潜力。
图6 通过无疤痕方法构建circFBXW4 RNA
无痕circRNA：高效蛋白翻译
团队成功利用 scarless 方法制备了翻译型 OVA circRNA，用于肿瘤疫苗。相比传统 PIE 方法，scarless circRNA 精准形成、无异源序列，能够有效翻译蛋白质并激活免疫系统。
小鼠实验显示，circRNA 疫苗显著抑制肿瘤生长，增强 CD8⁺ T 细胞和 NK 细胞浸润，同时建立持久免疫记忆，凸显 scarless 方法在大分子治疗 circRNA 制备和癌症免疫治疗中的潜力。
图7 无疤痕circRNA肿瘤疫苗试验
总结
研究表明，基于“无痕”方法的环状RNA不仅能避免引入外源序列，实现精准环化，还保持了天然低免疫原性优势。该方法可灵活应用于小分子治疗性circRNA的制备，同时也适用于长链翻译型circRNA，如用于癌症疫苗和蛋白替代治疗，能够高效表达目标蛋白并激活强烈的免疫应答，从而为环状RNA的安全高效应用提供了新的技术平台。
原文链接：
https://www.cell.com/molecular-therapy-family/nucleic-acids/fulltext/S2162-2531(25)00180-5?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2162253125001805%3Fshowall%3Dtrue
文章来源于RNAScript