前列腺癌(PCa)是男性最常见的实体器官恶性肿瘤。前列腺特异性抗原(PSA)在做PCa筛查试验时，往往导致患者的过度诊断和过度治疗[1]。并且，大约30%的前列腺癌病例会发展为转移性前列腺癌。因此，迫切需要探索PCa发展背后的详细机制。环状RNA (circRNA)具有独特的共价单链闭环结构。高通量测序已经确定许多circRNAs在细胞中具有关键的生理和病理作用。circRNAs可以通过结合和隔离microRNAs(miRNAs)来发挥其功能，也可以与RNA结合蛋白(RBPs)相互作用，甚至可以通过m6A依赖的转译来编码独特的肽[2]。在功能上，环状RNA参与许多生理过程，如维持干细胞多能性，控制细胞分化，调节细胞周期和凋亡，以及血管生成。然而，circRNA在PCa中的功能仍然知之甚少。

2022年12月，浙江大学医学院邵逸夫医院泌尿科薛定伟教授在Clinical and Translational Medicine发表文章Exosome-derived circTFDP2 promotes prostate cancer progression by preventing PARP1 from caspase-3-dependent cleavage。与PCa相关的circRNA—circTFDP2在PCa组织和细胞系中都上调。circTFDP2通过与PARP1相互作用并阻止其发生caspase-3依赖性的分裂，从而促进PCa细胞的增殖和转移。结果表明，RBPs的eIF4A3可调节circTFDP2的进展。此外，外泌体传递的circTFDP2在体内和体外都促进了PCa的肿瘤发生。本研究为前列腺癌提供了一个有前景的治疗靶点。

一、 circTFDP2在PCa中高表达

作者经过在50对PCa肿瘤和癌旁样本中筛选circRNA，发现hsa_circ_0008304蛋白来源于TFDP2，被命名为circTFDP2，在PCa样品中显著上调；circTFDP2表达与Gleason评分呈正相关；circTFDP2在转移灶的PCa患者中高表达。这些数据证实circTFDP2在前列腺癌中表达上调。Sanger测序确认circTFDP2的环化位点。背靠背验证其成环；放线菌素D验证其稳定性；核质分离和FISH鉴定其定位于细胞核和细胞质。这些数据证实了circTFDP2是一个环状RNA。

 

图1. circTFDP2的筛选过程及特性

 

二、 eIF4A3在PCa中调控circTFDP2的生物发生

先前的研究表明，几种RBP可以调节circRNA的产生。因此，作者使用circinteractome数据库(https://circinteractome.nia.nih.gov/)识别了circTFDP2侧翼区域的潜在RBP位点和circTFDP2侧翼区域的两个假定eIF4A3结合位点。RIP实验证明eIF4A3与circTFDP2的侧翼区域结合。因此，作者假设eIF4A3控制circTFDP2的生物基因。过表达eIF4A3增强了circTFDP2的表达，而下调eIF4A3则降低了其表达。接下来，作者在50对PCa组织中检测了eIF4A3的表达，结果表明，与正常组织相比，eIF4A3在PCa组织中高表达。总之，这些数据揭示了eIF4A3在PCa组织中调控circTFDP2的生成。
 

图2. eIF4A3在PCa中调控circTFDP2的生物发生

 

三、circTFDP2促进PCa细胞增殖，抑制其凋亡并促进PCa细胞迁移

为了探索circTFDP2在PCa中的具体作用，设计了circTFDP2特异性siRNAs和过表达质粒，并转染到PCa细胞中。敲低circTFDP2显著降低PCa细胞的增殖能力，而过表达circTFDP2则增强了PCa细胞的增殖能力，降低凋亡；而circTFDP2过表达结果相反。WB结果表明，敲低circTFDP2增加了cleaved caspase-3、PARP1和Bax的表达，降低了Bcl-2的表达；circTFDP2过表达结果相反。随后，作者通过建立裸鼠异种移植瘤模型，在体内检测了circTFDP2的致癌作用。结果表明，circTFDP2的下调显著抑制了体内肿瘤的生长；过表达circTFDP2有相反结果。随后，作者评估了circTFDP2在PCa细胞转移中的作用。Transwell检测显示，敲低circTFDP2显著降低了PCa细胞的侵袭和迁移能力，而过表达则相反。此外，裸鼠转移模型的结果与细胞结果一致。综上表示，circTFDP2促进PCa细胞增殖，抑制其凋亡并促进PCa细胞转移。

 

图3. circTFDP2促进PCa细胞增殖，抑制其凋亡并促进PCa细胞转移

 

四、 circTFDP2与PARP1相互作用并阻止其裂解

为了确定circTFDP2调控PCa进展的分子机制，我们首先分析了circRNADb数据库(http://reprod.njmu.edu.cn/cgibin/circrnadb/ circrnadb .php)。结果显示，circTFDP2不存在内部核糖体进入位点(IRES)或开放阅读框(ORF)区域，提示circTFDP2蛋白编码潜力较低。随后，由于circTFDP2同时位于细胞核和细胞质中，猜测circTFDP2可能具有miRNA海绵的功能。但AGO2-RIP实验表明，circTFDP2不能与AGO2蛋白相互作用，表明其不能作为miRNA海绵。

接下来，作者设计circTFDP2探针进行pulldown实验，发现有26个蛋白与circTFDP2特异性相互作用。在这些RBP中，PARP1由于可以抵抗前列腺癌症，被选为潜在的下游。PARP1-RIP实验证实了PARP1与circTFDP2之间的相互作用。FISH和IF检测确定了PARP1和circTFDP2之间的共定位。这些数据表明circTFDP2和PARP1在PCa细胞中形成了RNA蛋白复合物。

基于PARP1和circTFDP2之间的相互作用，作者研究了PARP1是否影响circTFDP2的表达。结果显示，circTFDP2的过表达或敲低都不能改变PARP1的表达和定位，这表明circTFDP2在转录后水平上没有调节PARP1的表达。

但是，由于circTFDP2与PARP1结合，而PARP1的DNA结合区被活跃的caspase-3识别并切割，作者假设circTFDP2影响这一过程。

WB实验显示，过表达circTFDP2会降低裂解PARP1的表达，而敲低circTFDP2则会增加裂解PARP1的表达；circTFDP2敲低的PCa细胞中增强的PARP1裂解被caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK阻断，表明circTFDP2阻止了PARP1依赖caspase-3的活性裂解。上述数据表明circTFDP2可以减弱PARP1的裂解。

 

图4. circTFDP2与PARP1相互作用并阻止其裂解

 

五、 PARP1促进前列腺癌细胞增殖和迁移

PARP1是PARP中最重要的成员之一，参与应激反应、DNA修复和细胞凋亡等多种细胞过程。由于circTFDP2与PARP1结合并阻止其分裂，作者检测了50对PCa肿瘤和癌旁中PARP1的表达。结果显示，PARP1在PCa组织中高度表达。使用TCGA数据库进行分析后，得到了相同的结果。CCK-8和transwell结果显示，敲低PARP1显著降低了PCa细胞的增殖和迁移能力，而反之则反。这些数据说明PARP1促进了PCa细胞的增殖和迁移。
 

图5. PARP1促进前列腺癌细胞增殖和迁移

 

六、circTFDP2通过PARP1调节前列腺癌细胞的DNA损伤

由于PARP1是单链断裂修复的重要分子，作者推测circTFDP2也可能通过阻止PARP1的切割来影响DNA损伤修复。WB和IF检测发现，PARP1过表达降低DNA损伤标志物yH2A.X表达，反之则反。而circTFDP2的过表达减轻了PCa细胞的DNA损伤，敲低circTFDP2的抑制加重了DNA损伤，表明circTFDP2参与了PCa细胞的DNA损伤。随后，CCK-8检测显示敲低circTFDP2抑制PCa细胞的增殖能力，反之则反。这些数据表明circTFDP2通过PARP1促进了PCa的进展。
 

图6. circTFDP2通过PARP1调节前列腺癌细胞的DNA损伤

 

七、 外泌体递送的circTFDP2促进前列腺癌进展

新兴的研究表明，癌细胞分泌的外泌体在调节细胞内通讯中起着至关重要的作用，从而参与各种生物学过程。从PCa细胞系的细胞培养基中收集外泌体并进行特征分析。qPT-PCR检测显示，细胞培养基中的外泌体比细胞质中的外泌体含有更多的circTFDP2。并且，circTFDP2在过表达的PCa细胞培养液中的外泌体中含量更高。为了探索外泌体递送的circTFDP2在PCa细胞进展中的作用，作者进行了CCK-8和transwell检测。结果表明，来自circTFDP2过表达细胞的外泌体增强了PCa细胞的增殖和转移。体内异种移植瘤模型结果和体外细胞结果一致。综上所述，外泌体递送的circTFDP2促进了前列腺癌的进展。
 

图7. 外泌体递送的circTFDP2促进前列腺癌进展

 

原文链接

https://doi.org/10.1002/ctm2.1156

参考文献

[1] Vlachaki A, Baltogiannis D, Batistatou A, et al. Screening for prostate cancer: moving forward in the molecular era. J BUON.2018;23:1242-1248.

[2] Singh S, Shyamal S, Panda AC. Detecting RNA–RNA interactome. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2022;13:e1715.

转载请联系邮箱授权：circRNA@163.com
分类： circRNA-蛋白互作, circRNA分离与鉴定, circRNA功能验证, circRNA生成, circRNA翻译, circRNA过表达, miRNA Sponge, 亚细胞定位, 前列腺癌, 功能机制, 外泌体与微量样品分析, 实用工具, 数据库评论

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