“广东癌”？环状RNA为这个高发恶性肿瘤早期诊断和治疗提供帮助

 

1. 鼻咽癌中circPVT1的高表达与预后不良相关

作者结合两组RNA测序数据分析得出circPVT1在NPC中显著高表达，qRT-PCR和Sanger测序实验证实circPVT1来自8号染色体的一个lncRNA基因PVT1通过反向剪接形成。核质分离试验和荧光原位杂交证实circPVT1主要分布在细胞质，作者利用qRT-PCR实验发现circPVT1在NPC组织中高表达，原位杂交也证实了这一发现。另外，circPVT1的高表达与鼻咽癌患者的不良预后、临床分期、N分期和远处转移呈正相关。这些数据表明，circPVT1在鼻咽癌组织中有较高的表达并参与了鼻咽癌的发生发展过程。

图1. circPVT1在鼻咽癌中高表达并导致预后不良

作者利用过表达/敲低实验、划痕实验、Transwell实验来探究circPVT1对NPC细胞侵袭和转移的影响。结果显示过表达circPVT1后，NPC细胞的迁移和侵袭能力显著增强，而对NPC的细胞生长和增殖没有影响。作者建立过表达或低表达的肺转移模型，发现circPVT1过表达组的肺结节数量显著高于对照组。然后，作者通过裸鼠腹股沟淋巴结转移模型、发现circPVT1组的腹股沟淋巴结大于对照组，IHC实验表明circPVT1组淋巴结中泛细胞角蛋白阳性表达显著高于circPVT2敲除组。这些结果表明，circPVT1在体外和体内均可促进鼻咽癌的侵袭和转移。

图2.circPVT1促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭

作者为了探究circPVT1在鼻咽癌转移过程中的作用机制，利用生物素标记的circPVT1探针下调circPVT1鉴别了PVT1周围的结合蛋白，并利用RNA下拉实验、RIP实验、数据库预测等方法发现并证实了β-TrCP与circPVT1中230-280nt的片段结合作用。作者利用RNA下拉和RIP实验经过对照实验，发现circPVT1与β-TrCP的结合位点为β-TrCP的WD40结构域。划痕实验和Transwell实验进一步表明，过表达β-TrCP可以抑制NPC细胞的迁移和侵袭。综上所述，circPVT1与β-TrCP的WD40结构域相互作用，从而促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。

图3. circPVT1通过与β-TrCP结合促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭

作者过表达或敲低circPVT1后发现circPVT1不影响β-TrCP的表达，所以推测circPVT1可能通过影响β-TrCP与其底物的结合来调节其下游蛋白的表达。作者运用Co-IP实验、质谱分析等技术鉴定了260种蛋白，发现c-Myc对β-TrCP表现出高亲和力。经过一系列的Co-IP证实了β-TrCP的WD40结构域与c-Myc之间的结合。作者还发现β-TrCP的过度表达增强了鼻咽癌细胞中c-Myc的泛素化，并降低了c-Myc蛋白水平。划痕实验和Transwell试验表明，β-TrCP的过度表达抑制了NPC细胞的迁移和侵袭性。

图4. c-Myc是β-TrCP的泛素化底物

图5. circPVT1阻断β-TrCP与c-Myc的结合并抑制c-Myc泛素化

为了进一步探索下游基因，作者使用质谱仪检测circPVT1过表达后的蛋白质组图谱，对鉴定出的231个蛋白进行生物学功能分析，发现大部分与细胞粘附、细胞连接、细胞骨架相关。作者还通过上游因子分析发现，这其中与受c-Myc调控的蛋白不在少数。因此，原子力显微镜检测显示，过表达后的NPC细胞硬度和粘附性降低。进一步试验表明circPVT1可以诱导RhoA、RhoC和Vimentin的表达，而降低E-钙粘蛋白的表达，这些都是细胞黏附连接和细胞骨架重塑途径有关的几个关键分子。而c-Myc的下调则逆转了circPVT1诱导的RhoA、RhoC和Vimentin的上调，以及PVT1周围E-钙粘蛋白表达的降低。综上所述，细胞黏附连接和细胞骨架重塑是通过PVT1/β-TrCP/c-Myc轴来调节的。

最后为了探明整个通路，作者运用c-Myc过表达/敲除、qRT-PCR、生信分析等方法，发现了circPVT1启动子区有三个c-Myc潜在结合位点，过表达c-Myc可以增加circPVT1的转录水平，荧光素酶报告和ChIP-qPCR结果表明c-Myc可以促进circPVT1的转录。作者利用生信预测、RIP、过表达实验证实了剪接因子SRSF1能够促进鼻咽癌细胞中circPVT1的生物发生。Co-IP实验揭示了c-Myc和SRSF1之间的相互作用，c-Myc可以作为转录因子促进SRSF1的表达。IHC结果显示circPVT1的强度与NPC组织中c-Myc和SRSF1的水平呈正相关。这些结果表明，c-Myc不仅作为促进基因转录的转录因子，而且还增强了circPVT1前体的剪接，从而通过将转录与剪接结合促进了circPVT1的生物合成。

图7. c-Myc通过招募SRSF1来将转录与剪接偶联进而促进circPVT1的生成

该项研究探明了circPVT1在鼻咽癌细胞中的调节机制，证实了circPVD1通过与β-TrCP的结合抑制了泛素介导的c-Myc降解，这阻断了泛素E3连接酶β-TrCP与其靶c-Myc之间的相互作用，与此同时circPVT1还受到c-Myc和SRSF1的正向共调节。整个通路也是导致细胞骨架重塑和细胞粘附调节，并最终促进鼻咽癌细胞迁移和侵入的原因所在。该研究为鼻咽癌进展机制和鼻咽癌患者治疗的潜在靶点提供了新的见解。