Nat commun | 突变RIG-I通过激活CircRIG-I信号增强癌症相关炎症

与病原体特异性免疫反应不同，非特异性炎症病变有助于正常细胞的恶性转化。尽管炎症诱导肿瘤发生的机制尚未完全阐明，但已证实长时间的炎症对DNA突变和染色质不稳定发挥了刺激作用。因此，阐明癌症相关的炎症调节机制对癌症预防和治疗至关重要。RIG-I是一种模式识别受体(PRR)，与机体免疫反应具有非常精密的联系。有研究表明，RIG-I在肝癌中的表达呈下调趋势，表明其与肿瘤免疫逃避有关。然而，在结肠癌模型小鼠中缺失RIG-1表现出更严重的肠道炎症，并激活全身免疫反应。因此进一步探索结肠癌中RIG-I缺失引发的持续性炎症反应的潜在机制或许能够提供一种新的治疗结肠癌的策略。

2022年8月，北京大学吕丹团队在Nat commun发表文章“Mutant RIG-I enhances cancer-related inflammation through activation of CircRIG-I signaling”，在本文中，作者发现结肠癌患者中RIG-1基因存在移码种系突变，并且携带RIG-1移码突变的RIG-Ifs/fs小鼠更易发展为结肠炎相关结肠癌。此外，移码突变不仅中断RIG-I mRNA的翻译，而且能够改变RIG-I前体mRNA的二级结构并且抑制与DHX9的结合，最终诱导RIG-I转录本产生环状RNA（CircRIG-I）。机制上，CircRIG-I与DDX3x相互作用，进而刺激MAVS/TRAF5/TBK1信号级联，最终激活irf4介导的I型IFN转录，加重炎症损伤。相反，全反式维甲酸作为DHX9激动剂，通过抑制CircRIG-I的生成改善免疫病理。综上所述，该研究对移码突变RIG-I的作用进行了深入的探索，并提出了一种治疗结肠癌的潜在策略。

1、RIG-I突变与结肠癌的发展有关

首先作者对425个结肠癌患者血液进行测序分析后发现5例患者血液中RIG-I基因发生了移码突变，而350例健康患者中没有发现RIG-I基因突变。为了研究RIG-I的移码变体的生物学功能，作者利用CRISPR/Cas9技术构建了RIG-I移码突变小鼠（RIG-Ifs/fs小鼠），并进一步使用氧化偶氮甲烷和右旋糖酐硫酸酯钠(AOM-DSS)模型在RIG-Ifs/fs小鼠中诱导结肠炎相关癌症(CAC)。实验结果发现，与对照组小鼠相比RIG-Ifs/fs小鼠体重明显下降，且在AOM-DSS处理后的RIG-Ifs/fs小鼠中结肠癌诊断标志物明显升高。此外，RIG-Ifs/fs小鼠体内肿瘤数量和大小均显著增加，并且存在更多低级别腺癌。有趣的是，在AOM-DSS处理过程中，RIG-Ifs/fs小鼠的结肠中还能招募到更多的T细胞，这表明RIG-I移码突变有助于结肠癌的发展。

图1. RIG-I移码突变加剧结肠炎相关癌症

2、Rig移码突变增强机体炎症反应并促进CAC发展

为了进一步探究RIG-I移码突变对CAC的影响，作者通过2%DSS单独对RIG-Ifs/fs小鼠进行处理。结果显示，在DSS治疗后RIG-Ifs/fs小鼠比野生型小鼠表现出更高的死亡率、更短的结肠长度和更严重的结肠炎症损伤。随后作者对野生型和RIG-Ifs/fs小鼠结肠组织进行RNA测序(RNA-seq)分析，从而进一步研究RIG-I在宿主炎症反应中的作用。利用基因分析(GSEA)，作者发现RIG-I的移码突变促进肠细胞表达更高水平的I型IFN信号相关的基因。此外，作者通过qPCR检测实验进一步发现在RIG-Ifs/fs小鼠肝脏中表达高水平的炎症反应相关基因（Tnf-α和Isg15）。以上结果表明，RIG-I移码突变增强了上皮细胞I型IFN信号通路，加剧了组织炎性损伤。

图2.RIG-Ifs/fs小鼠对实验性结肠炎的易感性增加

3、RIG-I的移码突变通过促进I型IFN的产生限制病毒的复制

由于RIG-I移码突变对I型IFN的产生具有刺激作用，作者推测RIG-Ifs/fs小鼠可能对病毒感染具有抗性。因此，作者使用了水泡性口炎病毒(VSV)感染野生型和RIG-Ifs/fs小鼠。结果显示，与野生型小鼠相比，RIG-Ifs/fs小鼠存活率显著增高，并且小鼠肺部、脾脏和肝脏等多个器官的病毒复制均被抑制。与体内数据一致，作者还观察到RIG-Ifs/fs鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中病毒滴度较低，且IFN-stimulated基因的表达高于野生型MEFs。为了进一步证实RIG-I移码突变在I型IFN调控中的作用，作者使用RNA-seq分析了RIG-Ifs/fs与野生型MEFs之间差异表达的基因。分析结果显示，与对照细胞相比，RIG-Ifs/fs MEFs中主要富集I型IFN信号通路相关基因。而有趣的是，RIG-I在刺激机体先天免疫中发挥重要作用，所以RIG-I的缺失很难刺激I型IFN的产生，这与目前的结果相悖。因此，作者假设RIG-I的移码突变不仅在转录后水平上影响RIG-I的表达，而且可能对宿主免疫应答的调节具有刺激作用。

图3.RIG-I突变增强的免疫反应限制了病毒复制

4、RIG-I突变触发环状RIG-I的生成

首先，作者利用RNAfold web预测RIG-I基因的RNA结构，发现移码突变能够损坏其RIG-I前体RNA的二级结构。随后作者通过查阅已经发表的DHX9基因的CLIP-seq数据，发现DHX9作为调控环状RNA生成的关键蛋白，能够富集在RIG-I基因的Alu SINEs原件上。随后，作者也通过RNA-pulldown证实RIG-I与DHX9之前存在互作。而RIG-I的移码突变显著降低了其与DHX9的结合。由于DHX9在调控环状RNA生物发生中具有重要的作用，因此作者假设RIG-I的移码突变可以触发RIG-I转录本生成环状RNA。不出所料，作者通过RNA-seq鉴定到来源于RIG-I基因第5和12外显子的环状RNA并将其命名为CircRIG-I。该环状RNA主要存在于细胞质中，且在感染病毒的RIG-Ifs/fsMEFs中显著增加。以上结果表明，RIG-I的移码突变触发了CircRIG-I的产生。

图4.RIG-I移码突变刺激CircRIG-I生成

5、CircRIG-I在结肠癌中上调并增强宿主免疫反应

为了验证CircRIG-I在组织中的表达情况，作者通过qPCR检测到CircRIG-I在结肠癌组织中高表达，并且发现溃疡性结肠癌中CircRIG-I的表达水平高于息肉样结肠癌。此外，炎症灶中CircRIG-I的表达也显著高于正常组织，这也进一步证明了CircRIG-I参与肿瘤相关的炎症反应。随后，作者为了确定CircRIG-I是否影响I型IFN的产生，通过使用shRNA在不影响线性的RIG-I的情况下选择性地敲除CircRIG-I。实验结果显示，当VSV感染时抑制CircRIG-I表达在一定程度上削弱了野生型或RIG-Ifs/fs MEFs对I型IFN和ISG (Ifitm2)产生的刺激作用。而在HEK293T细胞中，CircRIG-I过表达能够显著抑制病毒复制，并且增强了I型IFN的产生和其他ISGs的表达。有研究报道I型IFN的产生与IRF3的磷酸化具有非常重要的作用，因此作者又在过表达CircRIG-I的细胞中检测了IRF3的磷酸化情况。实验结果显示，在过表达CircRIG-I的细胞中，IRF3的磷酸化水平显著升高。此外，与对照细胞相比，在过表达CircRIG-I的细胞中检测到IRF3的二聚体和核积累也相应增加。综上所述，该结果确定了CircRIG-I在调节宿主先天免疫中的刺激作用。

图5.CircRIG-I增强宿主固有免疫反应

6、CircRIG-I可激活DDX3x/MAVS/TRAF5/TBK1通路

为了探究CircRIG-I是否通过下游通路影响宿主免疫反应，作者通过过表达带有MS2标签的CircRIG-I进行了RNA-pulldown实验。对pulldown产物的质谱分析结果显示，DDX3x作为I型IFN信号通路的重要组成部分与CircRIG-I存在互作。为了研究CircRIG-I促进DDX3x激活的机制，作者使用免疫沉淀和质谱(MS)来鉴定CircRIG-I过表达和敲低时DDX3x相关蛋白的动态变化。利用该方法，作者鉴定出多个与之前的报道一致的DDX3x相关蛋白，包括TBK1、EIF4G1和EIF3A等。进一步验证后发现CircRIG-I促进了DDX3x与MAVS、TRAF家族(TRAF1、TRAF4和TRAF5)以及TBK1的关联。从而表明CircRIG-I通过激活DDX3x刺激IRF3介导的先天免疫信号。

图6.CircRIG-I激活DDX3x介导的先天免疫信号

7、全反式维甲酸通过抑制CircRIG-I表达改善免疫病理

有研究报道，全反式维甲酸(ATRA)参与RIG-I表达的调控。有趣的是，作者发现ATRA治疗也促进了Dhx9的表达，这对CircRIG-I的生物发生具有负调控左右。当通过ATRA处理野生型MEFs时，随着ATRA剂量的增加，RIG-I mRNA表达水平逐渐上调，CircRIG-I表达也逐渐被抑制。而在RIG-I移码突变的背景下，ATRA处理也能抑制CircRIG-I的表达。鉴于CircRIG-I的上调对于RIG-Ifs/fs小鼠的免疫应答增强至关重要，因此作者推测ATRA处理可以改善用DSS治疗的RIG-Ifs/fs小鼠的病理损伤。为此，作者在DSS存在的情况下使用ATRA处理野生型或RIG-Ifs/fs小鼠。结果显示，尽管野生型小鼠的病理病变具有轻度缓解，但通过生存曲线、结肠长度和组织学分析后发现，ATRA显著改善了RIG-Ifs/fs小鼠急性dss诱导的结肠炎的结局。该结果表明，ATRA对治疗RIG-I移码突变引起的严重结肠炎症具有非常重要的作用。

图7.全反式维甲酸缓解RIG-Ifs/fs结肠炎性病变

综上所述，在本文中作者证明了RIG-I的移码突变触发CircRIG-I，进而激活DDX3x/MAVS/TRAF5/TBK1轴，最终促进I型IFN的产生和结肠炎症损伤。与此相反，ATRA作为CircRIG-I的抑制因子，可治疗RIG-I移码突变引起的严重结肠炎症。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36402769/

参考文献：

[1] Song Jia,Zhao Wei,Zhang Xin et al. Mutant RIG-I enhances cancer-related inflammation through activation of circRIG-I signaling.[J] .Nat Commun, 2022, 13: 7096.

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