引言.

circRNA独特的功能和稳定的结构让它有望成为许多疾病的生物标志物,然而同源线性RNA往往会干扰circRNA的检测,这成为了circRNA临床检测的绊脚石。为了克服这一困难,近日山东第一医科大学焦建伟团队开发出一种用于检测circRNA的新方法——ihHCR系统ihHCR系统不仅能够避免同源线性RNA的干扰,还能应用于体外定量和体内circRNA成像

01.ihHCR简介

ih: hairpin

HCR: hybridization chain reaction

ihHCR:基于circRNA保守的BSJ序列和杂交反应链置换,双功能的ih探针能够结合circRNA并启动HCR

• ih探针包含circRNA互补片段与H1互补区域

• 两个发卡探针H1和H2通过ihHCR形成级联来放大信号

– H1用BHQ1和FAM染料标记,形成一个自淬灭探针(self-quenching probe),当发卡结构打开,荧光可以恢复。

– H2是一个连接器,当circRNA存在时,H1会结合到ih探针,这会触发H1和H2的级联杂交。

ih探针的识别区域(e*,d*)与circRNA的BSJ序列(e,d)杂交,使得ih探针结构打开将启动链(b*,a*)暴露出来;启动链(b*,a*)随后会与H1探针(a,b)结合破坏其发卡结构,从而恢复荧光信号;与此同时,ih探针的(c,b\)部分会暴露并与H2 (c*,b)杂交,并暴露(b*,a*);随后,H1和H2会不断地交替结合,从而产生一个非常大的杂交信号。

对于同源线性RNA,由于(e,d)序列很短,阻止了ih探针茎环结构的破坏,从而阻止了随后的HCR。这在很大程度上保证了circRNA检测的特异性。

 

02.ihHCR小试牛刀

circMTO1表达水平减少与肝细胞癌(HCC)病人的不良生存率关联。为了检验技术的可行性,作者针对circMTO1设计了ihHCR系统。

• 通过凝胶电泳(PAGE, 图A)可以看出ihHCR产生了长的杂交链 —— 在lane4的顶端有一条明显的DNA条带,而在没有circRNA分子时,H1/H2、ih以及同源线性RNA所对应的lane2、lane3和lane5并没有出现明显的DNA条带。

• 同时,用原子力显微成像(AFM, 图D/E/F)更直观地展示了circRNA与ihHCR系统形成了长的DNA分子。

• 利用荧光分光光度法(fluorescence spectrophotometry ,图 B/C),基于H1探针信号参考,ihHCR系统包含circRNA的信号强度要显著高于不包含circRNA的;另外,同源线性RNA并不影响ihHCR系统检测的信号强度(蓝色和紫色信号)。

03.ihHCR敏感性检测

在相对一致的条件下,通过对不同浓度的circMTO1进行荧光分光光度法定量(荧光强度FL表示circRNA所诱导的ihHCR的程度),获得波长峰值在522nm(图C),而荧光强度FL能够被一元线性方程拟合,表明荧光强度与circRNA浓度具有很强的一元线性关系(=0.982,图D)。

通过计算,ihHCR系统的检测极限是43.6 pM——与金标准qPCR检测RNA的相似,表明该方法能够满足circRNA在体外检测的要求

 

04.ihHCR特异性检测

为了检测特异性,作者对不同浓度的突变circRNA、miRNA-21以及同源线性RNA进行了测试

• 序列的随机碱基突变用于检测ihHCR区分单碱基错配的能力

• miRNA-21作为模拟的随机序列

结果显示

• 不同浓度下,相比只有同源线性RNA的icHCR系统,包含circRNA的系统具有更高的荧光信号(图 A)

• 正常circRNA的信号强度是单碱基突变circRNA的2倍,是两个碱基突变的6倍;当miRNA-21加入,几乎没有信号显示(图B)

这些结果都表明ihHCR具有circRNA检测的特异性。

 

05.ihHCR细胞与组织检测

在检测ihHCR应用到生物学样品之前,作者首先证明了不同浓度circMTO1在buffer以及10%血清中具有不同的信号强度(图A);随后检测不同细胞株发现,与之前的研究一致circMTO1在不同的HCC细胞株(HepG2和Huh7.5.1)的信号强度要比正常细胞株(H9C2和HeLa)低(图B);继而,作者用ihHCR系统对9个正常个体以及11个HCC病人的组织样品进行了检测,健康个体的信号强度要明显高于HCC样品(图C),表达趋势进一步被qRT-PCR所检测到(图D)。

06.ihHCR活细胞成像

ihHCR circRNA体外检测非常成功,为了检测ihHCR在活细胞检测的能力,作者挑选了正常肝癌细胞L02与HCC细胞HepG2分别进行ihHCR荧光成像与FISH荧光成像——结果显示ihHCR相比FISH具有更强的荧光信号,暗示了ihHCR比FISH具有更高的敏感性(图A/B)。

ihHCR优缺点一览

ihHCR系统不仅能够避免同源线性RNA的干扰,还能应用于体外定量和体内circRNA成像。

该方法的优势

• 避免同源线性RNA假阳性的干扰;

• 能直接检测复杂生物学样品的circRNA;

• 基于原位DNA自组装,该方法能够对细胞中低丰度的circRNA进行分析;

• 该方法也可以通过替换ih识别探针应用于其他非编码RNA。

该方法的缺陷

• ihHCR探针进入细胞的效率并不高。

当然,目前文章仅仅用ihHCR对circMTO1进行了检测,该系统是否能够检测其他circRNA还需要后续的试验进一步验证。

 

参考文献:

Jiao J, Wang G, Zou F, et al. Bifunctional probe-assisted hybridization chain reaction for circular RNA detection and live-cell imaging[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2022: 133145.

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