环状RNA相对mRNA,具有结构稳定、开发成本低和对机体先天免疫影响小的优势。近些年,环状RNA不仅仅在基础科研方面大放异彩,其生物学功能不断被挖掘,许多具有翻译多肽作用的环状RNA分子也被发现。产业化前景十分光明。
2017年,出生于中国台湾的现任斯坦福大学首席研究员Howard Y. Chang在Molecular Cell杂志报道细胞可以通过RIG-I识别细胞内生成的环状RNA(内源环状RNA)和体外合成环化的环状RNA(外源环状RNA),RIG-I识别外源环状RNA后可激活自身免疫效应通路[1]。2019年,Howard Y. Chang团队再次在Molecular Cell杂志发表文章证明了外源合成的环状RNA确实可以诱导自身免疫效应相关的通路,他们发现细胞通过识别是否携带m6A修饰来识别内源和外源环状RNA,外源的不带m6A修饰的环状RNA可以激活内源性自身免疫效应相关的通路[2]。

2021年,中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)陈玲玲研究组在Molecular Cell上发表相关研究,首先比较了不同方式体外合成环形RNA的效率及免疫原性,发现T4 RNA连接酶合成的环形RNA具有较低的免疫原性。为进一步应用体外合成的环形RNA奠定了重要基础,也为进一步研发基于环形RNA技术的核酸适配体和基因治疗领域带来可期前景[3]。环状RNA作为mRNA 2.0,具有相对于mRNA更大的开发潜力,环状RNA的体外制备和环化产物的翻译潜能是其转化的基础。

半个多月前,中科院上海营养健康所的王泽峰研究团队在Nature Communications杂志在线发表了研究环形RNA翻译的相关研究,鉴定出近千个能翻译的内源性环形RNA,其中一半可通过滚环翻译来合成大分子量的蛋白。此研究表明在人的转录组中存在普遍的非帽依赖性翻译[4]。随着环状RNA翻译机制的不断挖掘,也再次证明了环状RNA的翻译模式受多重因素的影响。
2022年7月18日,Howard Y. Chang团队在 Nature Biotechnology 发表了文章Engineering circular RNA for enhanced protein production。作者探讨了影响环状RNA翻译的五个因素,并通过优化相关条件,将环状RNA蛋白质产量提高了数百倍,在体外和体内条件下可提供更加丰富和持久的翻译蛋白产物。

为检测影响环状RNA蛋白表达的影响因素,缩短高通量设计-构建-测试周期,作者设计了以BsmBI限制性内切酶位点为连接位点的,包含六个主要部分的质粒系统(Golden Gate8和Gibson cloning9)。先前研究表明,环状RNA可以触发体内免疫反应,这可以通过用m6A修饰环状RNA来避免。m6A掺入也不会对环状RNA翻译产生不利影响。为了最大限度地提高 环状RNA 的蛋白质翻译效率,作者主要探讨了影响环状RNA蛋白产量的以下五个因素:

 

 因素1.  核酸序列的方向性和疤痕(scar)序列的影响

虽然,IRES直接位于基因上游具有较高的翻译效率,内含子剪接疤痕对IRES介导的环状RNA翻译影响不大。此外,通过添加50 nt间隔子,将IRES和相关基因从剪接疤痕中分离出来,可以改善环状RNA的翻译(图1)。

图1. 拓扑结构和间隔序列对蛋白翻译影响

 

 因素2和因素3.  5′和3′UTR可以提高circRNA的翻译

mRNAs中的5′和3′UTR可以招募RNA结合蛋白(RBPs),从而实现强大的翻译以及转录后调控的各个方面。作者在环状RNA上验证发现,5′UTR区域增加PABP基序和eIF4G招募适体对翻译的改善最大,用短或全长形式的HBA1 3′UTR替换3′UTR端间隔区域也可以显著提高翻译强度。

图2. 5′和3′UTR序列对蛋白翻译的影响

 

因素4.  内部核糖体进入位点(IRES)

IREs是一种多样且高度结构化的RNA区域,以iCVB3为例,其结构可分为七个区域,任一结构域的缺失或突变均会影响环状RNA的翻译,全长IRES对于高效的环状RNA翻译是必要的。

图3. IRES结构域缺失对蛋白翻译的影响

 

因素5.  翻译起始因子eIF4G的招募适体(Apt-eIF4G)

eIF4G在启动环状RNA中IRESs的翻译中起着关键作用,作者设计了iCVB3的合成变体,在其中合理地插入Apt-eIF4G,结构域IV的十字形结构最容易插入Apt-eIF4G。在结构域IV的远端和近端环中分别插入Apt-eIF4G的synIRES06和synIRES08均显示出比野生型iCVB3显著改善的翻译。

图4. Apt-eIF4G插入位置对蛋白翻译的影响

 

体外大规模screens

作者通过优化和组合以上影响因素,对影响翻译的最佳条件,在HeLa、HepG2和HEK293T细胞中进行了筛选。体外条件下,在Hela细胞中成功将 环状RNA 翻译的蛋白质产量提高了数百倍(NanoLuc荧光倍数增加224倍,AkaLuc荧光倍数增加200倍以上),在体外具有比线性 mRNA 更高的翻译效率。

图5. 优化结构的环状RNA翻译效率对比(Hela细胞)

 

体内蛋白翻译验证

随后,作者使用优化的环状RNA结构,分别设计了编码荧光素酶 NanoLuc和人促红细胞生成素(hEPO)的蛋白质。优化后的工程化环状RNA可以重复给药,且具有相对于mRNA更加稳定持久的蛋白表达。

环状RNA作为mRNA 2.0,具有相对于mRNA更大的开发潜力,环状RNA人工制备技术是其开发和转化的基础。吉赛生物的序列重设计法、圆因生物的Ⅰ型内含子自剪切法、环码生物的Ⅱ型内含子自剪切法体外制备环状RNA,是目前市面上较为流行的三类环状RNA人工制备方法。在发展环化策略的基础上,为了最大化环状RNA翻译,作者优化了五个影响翻译的因素:序列拓扑结构、5′和3′非翻译区、内部核糖体进入位点和合成适体启动翻译机制。在此设计原则基础上将环状RNA蛋白质产量提高了数百倍,在体外比mRNA提供更高产量的翻译,在体内提供更持久的翻译,并具有广阔的应用推广前景。

 

原文链接:https:/ / doi.org/10.1038/ s41587-022-01393-0

参考文献:

[1]. Chen, Y . G. et al. Sensing self and foreign circular RNAs by intron identity. Mol. Cell 67, 228–238 (2017).

[2]. Chen, Y.G., et al., N6-Methyladenosine Modification Controls Circular RNA Immunity. Mol Cell, 2019. 76(1): p. 96-109 e9.

[3]. Liu et al., RNA circles with minimized immunogenicity as potent PKR inhibitors, Molecular Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.11.019

[4]. Fan, X., Yang, Y., Chen, C. et al. Pervasive translation of circular RNAs driven by short IRES-like elements. Nat Commun 13, 3751 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31327-y

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