近期Molecular Cancer期刊在线发表了徐州医科大学附属医院宋军主任一篇题为The circular RNA circSPARC enhances the migration and proliferation of colorectal cancer by regulating the JAK/STAT pathway的文章,该研究利用高通量测序技术分析三组结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)组织及相应的癌旁组织的circRNA表达情况,结合相应的数据库进行差异分析,锁定circSPARC分子,进一步机制研究表明,circSPARC通过海绵作用吸附miR-485-3p来上调JAK2的表达,并最终促进磷酸化-STAT3的积累。此外,circSPARC结合FUS,促进了p-STAT3的核移位。研究结论表明,circSPARC可作为CRC患者的诊断标志物,沉默circSPARC可作为治疗CRC的有效措施。

 

研究路线

 

 

1、选CRC相关的circRNAs

通过分析3对CRC癌组织和癌旁正常组织的circRNA转录组测序结果,发现CRC组织中差异表达前10位的circRNA分子,并利用qRT-PCR在CRC组织和癌旁组织中对circSPARC进行了验证。随后将转录组测序结果与GEO数据库中找到的三个与CRC相关的数据GSE121895、 GSE138589 和 GSE142837做差异分析,在所有的结果中,circSPARC被认为是表达量最高的circRNA分子。进一步通过共定位组织荧光染色确定circSPARC在CRC组织中高表达,通过qRT-PCR结果分析确定circSPARC在患者术前血浆中具有明显上调情况,患者的总体存活率也明显降低,提示circSPARC与CRC病人的预后关系紧密。

图1 CRC中circSPARC表达上调

2、鉴定circSPARC的特性

查阅circBASE数据库发现,Hsa_circ_0004104 其实是由SPARC 基因的四个外显子(6号至9号外显子)组成。Sanger测序证实了反向剪切位点。circSPARC相比于其来源基因SPARC线性mRNA更加耐受RNase R的降解,以及qRT-PCR结果排除RNA来自于基因重组,说明只能利用反向引物从cDNA模板扩增得到。均证明circSPARC是由外显子头尾剪切形成稳定环状结构的环状RNA分子。FISH实验以及核质分离qRT-PCR实验结果表明细胞中的circSPARC既存在于细胞核中也存在于细胞质中,但主要存在于细胞质中。

图2 circSPARC由SPARC基因的四个外显子反向剪切形成且主要存在细胞质中

 

3、circSPARC功能研究

首先设计circSPARC过表达载体OE-circSPARC,随后使用慢病毒转染构建sh-circSPARC的稳转株干扰circSPARC的表达。分别使用Transwell和划痕实验证明过表达circSPARC可以显著性促进CRC细胞的迁移和侵袭。过表达circSPARC可以显著性促进CRC细胞的增殖(CCK8实验)和克隆形成。TRCirc网站预测CTCF是circSPARC潜在的上游调控因子。利用GEPIA数据库预测发现CTCF在CRC中表达上调,且与SPARC的表达呈正相关。当下调CTCF后,qRT-PCR检测发现circSPARC、SPARC pre-mRNA、SPARC mRNA的表达均降低,表明上游转录因子CTCF可能影响SPARC pre-mRNA的表达,从而导致下游circSPARC和SPARC mRNA的表达增加。CHIP实验表明CTCF与SPARC的启动子区域靶向结合,说明CTCF是circSPARC在CRC中的转录启动子。

图3 circSPARC调控CRC细胞的增殖、迁移和侵袭,CTCF可能作为circSPARC的上游调控因子

4、circSPARC调控JAK2/STAT3信号通路

已有研究发现,在CRC细胞中,抑制JAK1, 2/STAT3信号可诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期,减少肿瘤细胞侵袭。根据RNA测序以及KEGG分析推断circSPARC可能通过JAK/STAT信号通路在CRC中发挥作用。随后分别在蛋白质和RNA水平验证发现circSPARC显著性影响了JAK2表达,而STAT3的表达无显著性变化。使用FISH、IF共定位对CRC组织进行双染标记发现在circSPARC高表达的组织中JAK2高表达。为了阐明JAK2/STAT3通路是否介导了circSPARC对CRC进展的调控作用,研究者在过表达circSPARC的细胞中加入JAK2/STAT3的抑制剂TG101348处理细胞,随后对细胞的迁移,侵袭和增殖进行了验证,发现抑制剂TG101348逆转过表达circSPARC对CRC细胞迁移,侵袭和增殖能力的促进作用。说明circSPARC通过增加JAK2 mRNA的表达来促进JAK2向p-JAK2的自磷酸化,从而在不改变STAT3表达的情况下导致p-STAT3的增加。

图4 circSPARC调控JAK2/STAT3信号通路参与癌细胞生物学功能的调节

5、circSPARC海绵吸附miR-485-3p增强JAK2活性

由于主要位于细胞质中的环状RNA通常作为miRNA海绵发挥作用,作者分别使用CircInteractome和TargetScan 数据库预测靶向circSPARC和JAK2的miRNA分子,最终筛选出两者交叉重叠的miR-485-3p,miR-646,miR-663b,可能参与CRC细胞的生理学功能。

在这三种miRNA分子中,敲低CRC细胞中circSPARC时miR-485-3p升高,过表达circSPARC时其水平降低。临床样本分析,发现CRC组织中miR-485-3p表达水平明显下调,circSPARC与miR-485-3p的表达呈负相关。双荧光素酶报告基因实验证明miR-485-3p可以直接结合circSPARC。miR-485-3p过表达显著降低了CRC细胞中JAK2的mRNA和蛋白水平,下调miR-485-3p则显示相反的结果,使用双荧光素酶报告基因实验证明miR-485-3p通过靶向JAK2发挥对于CRC细胞的影响。

图5 miR-485-3p直接与circSPARC结合,miR-485-3p抑制JAK2活性

6、circSPARC靶向miR-485-3p调控JAK2表达,抑制CRC细胞活性

沉默circSPARC可以抑制CRC细胞的迁移,侵袭和增殖,共转染sh-circSPARC和miR-485-3p inhibitor可以抵消这种效应。过表达circSPARC可以促进CRC细胞中JAK2 mRNA的表达,共转染circSPARC过表达载体和miR-485-3p mimic可以抵消这种效应。沉默circSPARC可抑制CRC细胞中JAK2蛋白的表达,共转染miR-485-3p inhibitor可以抵消这种效应。荧光素酶报告基因分析显示过表达circSPARC可以提高荧光素酶报告基因的活性,共转染circSPARC过表达载体和miR-485-3p mimic可以抵消这种影响。

图6 circSPARC通过靶向miR-485-3p调控JAK2表达,抑制CRC细胞活性

7、circSPARC 结合FUS促进 CRCSTAT3的核转移

近期有文献报道,FUS与STAT3的结合有助于STAT3核移位和激活,查阅CircInteractome数据库发现circSPARC与FUS之间可能存在相互作用。通过ChIRP和RIP实验验证circSPARC与FUS之间存在相互作用,WB结果显示CRC细胞中FUS受到circSPARC的正向调控,沉默circSPARC抑制FUS表达,过表达circSPARC促进FUS表达。免疫共沉淀验证发现CRC细胞中FUS与STAT3的相互作用,WB结果显示FUS的下调逆转了过表达circSPARC引起的CRC细胞核中p-STAT3的上调,且CRC细胞中总STAT3的水平没有变化,进一步通过IF实验验证发现上调FUS逆转了下调circSPARC引起的p-STAT3的核移位的下降。

图7 circSPARC通过结合FUS增强CRC中STAT3的核移位

8、体内实验证明沉默circSPARC可以抑制肿瘤生长和转移

通过皮下肿瘤异种移植方法在4 ~ 6周龄BALB/c雌性裸鼠完成造模,sh-circSPARC组的裸鼠肿瘤组织的重量和体积明显低于sh-NC组。WB和IHC结果表明sh-circSPARC组中JAK2和p-STAT3的表达明显下调,肿瘤的增长减弱。活体成像结果显示sh-circSPARC组不易向裸鼠的肺部组织转移,HE和IHC染色表明sh-circSPARC组的裸鼠肺部组织部位相比于对照组形成较小的肿瘤灶。

图8 circSPARC增强体内肿瘤生长和转移

9、研究讨论

图9 circSPARC分别通过结合蛋白以及miRNA sponge共同调控STAT3的激活,促进肿瘤的发生发展

文章首先对三对CRC组织和癌旁正常组织进行转录组测序,筛选并验证出CRC组织中表达上调程度较高的circSPARC,与患者的预后紧密相关。在信号机制研究方面,作者发现circSPARC在CRC进展过程中作为致癌的circRNA发挥作用,并揭示了一个新的调控通路,circSPARC通过海绵吸附miR-485-3p来上调JAK2的表达,以增强STAT3的激活。此外,circSPARC招募FUS,促进活化的STAT3的核转位。这些发现清楚地表明circSPARC可以通过两种不同的途径调控p-STAT3的水平。从而影响CRC细胞的增殖、迁移和侵袭等生理过程,起到促进CRC进展的作用,提示circSPARC作为一种癌症相关的circRNA,可能成为CRC新的潜在诊断和治疗靶点。

参考文献:

1. Jiaqi Wang , Yi Zhang , Hu Song , Hang Yin , Tao Jiang , Yixin Xu, Lianyu Liu, Hongyu Wang, Hong Gao, Renhao Wang, Jun Song. The circular RNA circSPARC enhances the migration and proliferation of colorectal cancer by regulating the JAK/STAT pathway. Mol Cancer. (2021) 20:81. https://doi.org/10.1186/s12943-021-01375-x.

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