3月11日，Molecular Therapy杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授的最新研究成果，报道circSKA3可以结合TKS5和Integrin β1，诱导侵袭性伪足的形成，促进乳腺癌转移（[1]）。
本文发现了circSKA3可促进TKS5定位至细胞膜，与Integrin β1相互作用后促进侵袭性伪足的形成，印证了circRNA与蛋白相互作用的重要生物学功能。有趣的是同样序列的线性RNA不具有这一功能，说明circRNA具有特有的蛋白相互作用方式和功能机制。下面就让我们一起学习一下吧：
如何发现circSKA3的？
作者从八株乳腺癌细胞系的芯片分析数据中发现circSKA3显著高表达，QPCR在各种肿瘤和非肿瘤细胞系中检测了circSKA3的表达情况，表明circSKA3在乳腺癌细胞系中表达显著高于其他细胞。临床标本检测表明circSKA3在恶性乳腺癌中表达明显高于良性乳腺结节，并且circSKA3的表达与乳腺癌的分期有关，分期越高，circSKA3的表达也越高。
图1 乳腺癌高表达circSKA3，与恶性程度相关 （[1]）
功能分析表明干扰circSKA3可抑制细胞增殖，抑制细胞转移侵袭。过表达circSKA3则促进细胞增殖和迁移侵袭，但过表达不成环的circSKA3序列（linSKA3）没有这些功能，说明是成环后的circSKA3才能促进细胞的增殖和迁移侵袭。
图2 circSKA3促进细胞侵袭迁移 （[1]）
如何发现和证明circSKA3与侵袭性伪足的关系？
实验中作者发现过表达circSKA3后细胞的伪足增多，用已知的伪足相关蛋白做pull-down分析，结果发现TKS5和Integrin β1（Itgb1）能够明显捕获circSKA3分子，其他的蛋白没有检测到显著的富集作用。pull-down结果也表明TKS5和Integrin β1仅能捕获circSKA3分子，但其对应的SKA3 mRNA富集效果远不如circSKA3，说明这两个蛋白是特异性结合circSKA3的。circSKA3的反义探针也可捕获到TKS5和Itgb1。circSKA3的干扰RNA可抑制这些现象。
图3 circSKA3与TKS5和Itgb1相互作用 （[1]）
进一步，基于细胞组分的分离和检测，作者发现circSKA3可特异性定位于伪足中，但SKA3的mRNA不具有这个定位现象。circSKA3的干扰RNA还能显著抑制Tsk5在细胞膜和伪足中的定位。过表达circSKA3则促进Tsk5在细胞膜和伪足中的定位。更有趣的是，已知在MB231细胞中circSKA3表达量要高于MCF-7，作者也发现MB231细胞中膜结合的Tks5也多，但两种细胞中Tks5总蛋白并无明显差别，因此circSKA3可能具有促进Tks5定位到细胞膜的功能。
图4 circSKA3促进Tks5定位到细胞膜 （[1]）
Itgb1往往定位在细胞膜的位置，Tks5可以在细胞膜和细胞质中穿梭定位，circSKA在其中起了什么作用呢？过表达circSKA3促进Tks5定位到细胞膜，也能促进Tks5与Itgb1的相互作用。通过分别设计过表达circSKA3，干扰circSKA3，RNase A处理，干扰Itgb1的实验条件，反复分析circSKA3，Tks5和Itgb1的相互作用关系。
图5 circSKA3，Tks5和Itgb1相互作用 （[1]）
共聚焦显微镜分析gelatin degradation可定量分析侵袭性伪足生成效率。分别设计干扰circSKA3，干扰Itgb1等条件。结果显示circSKA3，Tks5和Itgb1三者的相互作用能够促进侵袭性伪足的形成。
图6 circSKA3，Tks5和Itgb1相互作用促进伪足形成 （[1]）
进一步，基于分子模拟（docking）分析，作者预测到circSKA3分别与Tks5和Itgb1相互作用的位点，设计相应的突变载体验证三者的相互作用关系。
图7 circSKA3，Tks5和Itgb1相互作用位点分析 （[1]）
最后，MCF-7中过表达circSKA3，MB231细胞中干扰circSKA3后皮下注射构建裸鼠成瘤模型，分析circSKA3与肿瘤增殖和侵袭的关系。结果表明过表达circSKA3后MCF-7肿瘤生长速度明显加快，伪足数目增多。干扰circSKA3后的MB231细胞肿瘤生长显著下降，Tks5定位到细胞膜的比例降低。
图8 体内验证circSKA3与肿瘤增殖和侵袭的关系 （[1]）
本文的故事再次印证了circRNA与蛋白相互作用的重要生物学功能，并且circRNA的序列只有成环后才有特有的结合相关蛋白的机制，丰富了我们对circRNA机制的认识。
参考文献
1. William W Du, W.Y., Xiangmin Li, Ling Fang, Nan Wu, Feiya Li , Yu Chen, Qihan He, Elizabeth Liu, Zhenguo Yang, Mingyao Liu, Faryal Mehwish Awan, Burton B Yang, The circular RNA circSKA3 binds integrin β1 to induce invadopodia formation enhancing breast cancer invasion. Molecular Therapy, 2020.