TA克隆

把PCR片段与具有3′-T突出端的载体DNA连接起来的实验方法。

T与A

T载体是带有3′-T突出端的开环载体，

PCR产物3’末端具有一个非模板依赖的A，

在连接酶作用下，把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点中

pMD18-T和pMD19-T的结构几乎是一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。

并非所有聚合酶都会在PCR产物末端加A。

Taq聚合酶具有末端转移酶活性，却不具有3′-5’端外切酶校准活性的特点，可在PCR产物的3’端加上一个非模板依赖碱基“A”。

但是具有3’到5’外切酶活性的高保真酶就不会产生A尾巴，如果下一步是做基因表达，扩增用高保真酶，只需用Taq酶在产物末端加A尾。

加A尾：

1.用高保真酶扩增完之后，在反应管中加入0.7-1μl的Taq聚合酶。

2.在72℃孵育8-10分钟。

3.立即进行纯化。这一点相当重要，否则高保真聚合酶会将A尾巴或T载体上的T尾巴切掉。

1）目的DNA片段和载体的制备；

2）目的DNA片段和载体的连接；

3）连接产物的转化；

4）克隆筛选。

1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。

2）加入5 μl（等量）的 Solution I。

3）16℃反应30分钟（2 kbp以上长片段PCR产物进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时）。

4）全量（10 μl）加入至100 μl 感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6）加入890 μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。

7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

8）挑选白色菌落，鉴定载体中插入片段的长度大小。