苏州大学医学院附属第三医院的吴昌平教授在Journal of Hematology & Oncology(IF=7.333)杂志在线发表了题为“Function and clinical significance of circRNAs in solid tumors”的关于circRNA在实体瘤的功能和临床意义的长篇综述。具体阐述了circRNA的特点、生物形成、功能和其与不同实体瘤的关系,同时也介绍了相关circRNA的研究策略。

1979年,洛克菲勒大学的Hsu和Coca-Prados第一次发现circRNA存在真核细胞的胞浆中。之后的几十年里,circRNA一直被认为是剪切错误的产物。circRNA是一类不同于线性mRNA的普遍存在的、稳定的、保守的非编码RNA,因为它没有5’ 端帽子和3’端polyA尾,而且经常在不同组织和组织中特异性表达。随着RNA-seq技术和生物信息学的发展,大量的circRNAs被研究人员发现。circRNAs主要有四种类型,分别为只含有外显子的ecircRNA、只含有内含子的ciRNA、同时含有外显子和内含子的EIciRNA和intergenic circRNA。

  1. circRNA的特点
  2. 丰富性和多样性: 真核细胞目前已发现了超过20000种circRNAs;
  3. 稳定性: circRNAs的半衰期很长,因为它没有5’ 端帽子和3’端polyA尾,不容易为外切酶降解,导致其的稳定性远远大于mRNA的;
  4. 保守性:circRNAs中的一些序列在许多物种中都是保守的,如人、小鼠、线虫、斑马鱼、果蝇、原生生物和植物等;
  5. 定位特异性:大多数circRNAs是属于ecircRNA,主要定位于胞浆;而含有内含子的ciRNA 和 EIciRNA,主要定位于真核细胞的核内;
  6. 表达特异性:circRNAs经常会特异性表达在不同的组织和不同的发育阶段。
  7. ecircRNAs和EIciRNAs的形成机制
  8. 内含子配对引起的环化反应:内含子侧翼含有反向重复或者ALU原件会引起碱基配对,通过切除内含子获得ecircRNAs,最后保留部分内含子获得EIciRNAs;
  9. 套索引起的环化反应:即通过外显子跳跃获得ecircRNAs和EIciRNAs。外显子的5’端攻击3’端剪切位点,形成含有跳跃的2号和3号外显子的RNA套索与含有1号和4号外显子的mRNA,接着再形成EIciRNA和双RNA套索的两种产物;
  10. 依赖RBPs形成circRNA的方式:RBPs结合到内含子上下游的序列motif上,作为桥梁拉近侧翼内含子的距离,以形成circRNA。

  1. introns和intergenic circRNAs形成circRNAs的机制
  2. ciRNA的形成:pre-mRNA可被剪切为含有2’,5’—磷酸二酯的RNA套索,然后切除3’尾巴后形成ciRNA;
  3. 剪切的I型内含子形成circRNA:外源性鸟苷攻击内含子的5’端,通过转酯反应切除1号外显子;游离1号外显子的3’端羟基攻击2号外显子的5’端,形成线性内含子;靠近线性内含子3’端的2’羟基攻击5’端的磷酸二酯键,导致含有2’,5’—磷酸二酯的RNA套索形成和释放5’端的序列;最后切除RNA套索的3’尾巴,形成I型内含子的circRNA;
  4. 剪切的II型内含子形成circRNA:pre-mRN释放2号外显子,内含子3’端的2’羟基攻击5’端的磷酸二酯键,产生含有2’,5’—磷酸二酯的RNA套索和游离的1号外显子;
  5. 内含子包含片段(ICFs)侧翼的GT-AG剪切信号作为剪切供体和剪切受体,以环化连接形成intergenic circRNAs。

  1. circRNA的功能

a. 作为miRNA的sponge,通过碱基互补配对原则竞争性结合miRNA,吸附不同的miRNA,影响miRNA所靶向基因的表达;b.参与 RNAP II延伸;c. 参与可变性剪切;d. 参与翻译调节;e. 作为蛋白骨架;f. 有助于蛋白定位;g. 可作为翻译的模板;h. 参与组蛋白修饰;i. 促进RNA的成熟

  1. circRNA与不同实体瘤的关系

据报道,越来越多种circRNA参与许多肿瘤类型的发生发展,通过对肿瘤组织和癌旁正常组织的circRNA表达谱差异分析,发现某些circRNA在肿瘤中的表达水平上调或者下调,从而促进或者抑制肿瘤的生长,并且很有可能发展成为肿瘤治疗和预后的生物标志物。本篇综述总结了118篇关于circRNA对实体瘤影响的研究论文,包括9例肺癌、14例乳腺癌、3例食管鳞癌、20例胃癌、17例结直肠癌、16例肝癌、10例神经胶质瘤、7例膀胱癌、4例胰腺癌、5例骨肉瘤和14例其他类型肿瘤(2例卵巢癌、1例肾癌、1例甲状腺癌、1例基底细胞癌、1例皮肤鳞癌、2例口腔鳞状细胞癌、1例喉部鳞状细胞癌、1例下咽癌、2例胆管癌、1例宫颈癌和1例前列腺癌)。作者对研究论文中的每种肿瘤中涉及到的circRNAs种类、编码基因、推测的功能、差异表达水平、是否为miRNA的sponge、影响到的信号通路和对于的参考文献,都分别给予了详细的总结和介绍,让阅读这篇综述的研究者,更好地了解在不同肿瘤中哪几种circRNAs发挥了重要作用与其功能,也可以给专门研究某种肿瘤的研究者提供了研究方向。

  1. 研究circRNA的方法和技术

RNA-seq和基因芯片可用于检测肿瘤中的新circRNAs;RT-qPCR、micro-drop digital PCR、Northern Blotting和FISH技术可用于验证相关疾病相关的circRNA表达水平;过表达和敲低circRNAs验证其在癌细胞增殖和凋亡中的功能;生物信息学预测、荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀法、RNA pull-down实验联合MS质谱检测分析可用于揭示circRNA与miRNA 、circRNA和蛋白的相互结合;生物信息学分析circRNAs中的M6A、IRES和ORF元件,研究其蛋白编码能力;核糖体印记、核糖体IP、m6A IP、Western blotting和质谱都被广泛用于circRNA的验证实验。当然还有许多circRNA相关的数据库,如circBase, CircInteractome, CircNet和 Circ2Traits,提供研究人员查询circRNAs的基本信息和潜在的调控网络。

  1. circRNA的临床应用前景

由于circRNAs的多样性与肿瘤类型、恶性程度的不一样,有些circRNA可以促进肿瘤的发展,而另一些circRNA可以抑制肿瘤增殖、生长,所以circRNA可以是治疗靶点,也可以成为治疗载体。对于一些致癌性的circRNAs,可以利用siRNAs抑制circRNA的表达,而不会干扰正常基因的mRNA的表达;对于一些抑癌性的circRNAs,采取诱导circRNAs表达的基因疗法治疗肿瘤。另外,circRNAs具有高度稳定性和吸附miRNAs与某些蛋白的特点,提示circRNAs有可能作为运输载体,或者具有特异的结合位点,结合致癌性miRNAs和蛋白质,从而达到抑制肿瘤生长的目的。在精准医学方面,根据不同癌细胞类型和不同阶段的细胞,设计细胞特异性启动子,限定circRNAs在某种细胞的时空表达;或者对circRNAs与miRNAs、蛋白的结合位点进行增强修饰,增强circRNAs与两者的结合能力,更大发挥抑制致癌性miRNAs和蛋白的功能,进而抑制肿瘤的生长。因为circRNAs有可能作为蛋白翻译的模板,可设计可以表达肿瘤抑制蛋白的circRNAs,进一步将circRNAs转化为有效治疗肿瘤的手段。

参考文献

1. Geng Y, Jiang J, Wu C. Function and clinical significance of circRNAs in solid tumors. J Hematol Oncol. 2018 Jul 31;11(1):98. doi: 10.1186/s13045-018-0643-z.

 

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