间日疟原虫（Plasmodium vivax）是人类疟疾的主要病原体之一，目前尚无获批的间日疟疫苗。传播阻断疫苗（TBV）旨在通过诱导特异性抗体，抑制疟原虫在蚊虫体内的发育，Pvs25是该类疫苗研究的重要靶抗原。环状RNA（circRNA）具有共价闭环结构，在RNA稳定性、抗原表达持续时间及生产成本方面具有潜在优势，为疟疾疫苗研发提供了新的技术选择。
近期，泰国玛希隆大学Jetsumon Sattabongkot团队在Vaccine发表了题为“Circular RNA vaccines encoding Pvs25 induce antibodies that block Plasmodium vivax transmission”的研究论。
该研究构建了两种编码Pvs25抗原的circRNA-LNP疫苗，并与核苷修饰线性mRNA疫苗进行比较。两种circRNA疫苗均能引发Pvs25特异性体液和细胞免疫应答，所产生的抗体在蚊虫膜饲实验中表现出较强的传播阻断活性，为circRNA在间日疟传播阻断疫苗中的应用提供了实验依据。
Pvs25环状RNA疫苗的构建与表征
研究团队构建了两种编码Pvs25抗原的circRNA疫苗，分别为circRNA-Pvs25和融合MITD结构域的circRNA-Pvs25-MITD，并以核苷修饰线性mRNA-Pvs25疫苗作为对照。两种circRNA经PIE自剪接及纯化后，表现出符合环状结构的电泳特征及RNase R降解耐受性。
Western blot、流式细胞术及免疫荧光分析显示，三种RNA-LNP制剂均能介导Pvs25抗原表达，且表达水平及细胞定位模式相近。此外，三种制剂的平均粒径为62.48～68.73 nm，RNA包封效率为87.65%～89.58%。两种circRNA疫苗均可有效包封于LNP中，并实现体外Pvs25抗原表达，为后续免疫原性及传播阻断活性评价提供了基础。
图1. Pvs25环状RNA疫苗构建体的设计及Pvs25蛋白表达验证
Pvs25环状RNA疫苗的小鼠免疫原性
为评价两种Pvs25 circRNA疫苗的免疫原性，研究团队采用BALB/c小鼠进行免疫实验，分别给予3 μg或15 μg剂量的三种RNA疫苗，并于初次免疫4周后进行加强免疫。ELISA结果显示，三种疫苗均能诱导Pvs25特异性IgG抗体，加强免疫后抗体滴度明显升高。3 μg剂量下，各组抗体滴度相近；15 μg剂量下，线性mRNA疫苗诱导的抗体滴度显著高于两种circRNA疫苗。各组IgG1/IgG2a比值为1.1～1.4，抗体亲合力相近。
间接免疫荧光实验显示，三种疫苗诱导的抗体均能识别间日疟原虫动合子及雌性配子体/配子上的天然Pvs25抗原。与线性mRNA组相比，两种circRNA疫苗组的荧光信号较弱，可能与其Pvs25特异性抗体滴度较低有关。
图2. 采用ELISA检测抗体滴度、抗体亚型及抗体亲合力
图3. RNA疫苗诱导抗体的免疫荧光分析
Pvs25环状RNA疫苗的传播阻断活性
为评价Pvs25 RNA疫苗诱导抗体的传播阻断活性，研究团队采用直接膜饲实验（DMFA），将接受15 μg剂量疫苗免疫的小鼠混合血清分别稀释至1:2、1:10和1:50，与来自3名间日疟原虫感染者的血液混合后供大劣按蚊吸食。7天后计数蚊虫中肠卵囊，并计算传播降低活性（TRA）。
结果显示，空LNP对照组在1:2稀释条件下的TRA为−2%～24%。三种RNA疫苗组在1:2稀释时TRA均达到100%，1:10稀释时平均TRA约为98%；进一步稀释至1:50时，阻断活性有所下降，具有统计学显著性的TRA为54%～91%。综合3份感染者血样的实验结果，三种疫苗在各稀释条件下的TRA均无显著差异，表明两种Pvs25 circRNA疫苗诱导的抗体在膜饲实验中具有与线性mRNA疫苗相近的传播阻断活性。
图4. Pvs25 RNA疫苗诱导抗体的传播降低活性
Pvs25环状RNA疫苗的细胞免疫应答
为评价Pvs25 RNA疫苗诱导的细胞免疫应答，研究团队在加强免疫后第14天采集小鼠脾细胞，采用ELISpot进行检测。经Pvs25多肽刺激后，三种RNA疫苗均诱导了Pvs25特异性IFN-γ和IL-4分泌细胞应答。其中，线性mRNA疫苗组的应答水平总体高于两种circRNA疫苗，而两种circRNA疫苗的应答水平相近。
进一步采用R848和IL-2刺激脾细胞，检测Pvs25特异性抗体分泌细胞应答。三种RNA疫苗组均检测到特异性抗体分泌细胞，其中线性mRNA组的应答水平最高，circRNA-Pvs25-MITD组高于circRNA-Pvs25组。
图5. RNA疫苗诱导的Pvs25特异性细胞因子分泌细胞及记忆B细胞应答
总结
本研究评价了两种Pvs25 circRNA-LNP疫苗的抗原表达、免疫原性及传播阻断活性。与核苷修饰线性mRNA疫苗相比，两种circRNA疫苗诱导的抗体滴度较低，但其免疫血清在膜饲实验中仍具有传播阻断活性，为circRNA应用于间日疟传播阻断疫苗研究提供了实验依据。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X26010303