脑卒中是常见的致死、致残性疾病，其中急性缺血性卒中（AIS）占比较高。脑缺血后，神经元损伤、胶质细胞反应及神经网络重塑等过程共同影响功能恢复。近年来，环状RNA因结构稳定、调控功能多样，在卒中修复和核酸治疗中的应用受到关注。已有研究表明，外源性circSCMH1可促进卒中后脑修复和神经功能恢复，但其单剂量给药后如何在缺血脑内维持长期修复效应，仍有待进一步阐明。因此，解析circSCMH1的持续作用机制，对于理解卒中后脑修复过程及发展circRNA核酸治疗具有重要意义。
近日，东南大学姚红红团队在Brain发表研究论文：Circular RNA SCMH1 promotes persistent brain repair via N6-methyladenosine methylation post stroke。
该研究发现，单剂量外源circSCMH1可在卒中后梗死周围区诱导内源性circSCMH1持续升高，从而维持较长时间的脑修复效应。机制上，FTO通过m6A去甲基化促进circSCMH1生成，YTHDC1进一步识别circSCMH1上的m6A位点，并与 Exportin-4协同介导其核输出。Exportin-4功能不足会阻碍circSCMH1从细胞核转运至细胞质，进而削弱其持续脑修复作用。该研究为理解卒中后 circRNA核酸治疗的长效机制提供了新的依据。
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外源circSCMH1驱动内源circSCMH1生成
研究团队发现，单剂量外源circSCMH1在卒中后24小时给药后，可使梗死周围区circSCMH1持续升高，并维持至干预后第56天，而Scmh1线性mRNA未明显变化。为区分其来源，研究团队构建了带AAAAAA 标记的ΔcircSCMH1。结果显示，外源ΔcircSCMH1给药后24小时可检测到，但卒中后第28天已不可检测；此时circSCMH1仍持续升高，说明外源circSCMH1可驱动内源性circSCMH1生成，从而产生持续脑修复效应。
图1｜缺血性卒中小鼠中circSCMH1的自我维持机制
FTO/m6A调控卒中修复
围绕circSCMH1与FTO/m6A通路的关系，研究团队进一步发现，野生型circSCMH1可促进FTO入核并降低整体m6A甲基化水平，而m6A位点突变后，这一效应及功能改善作用均消失。进一步分析显示，小胶质细胞是FTO变化的主要细胞类型；卒中后小胶质细胞FTO表达下降、m6A水平升高。遗传动物模型表明，小胶质细胞中过表达FTO可改善感觉运动功能，敲除FTO则加重功能障碍，提示小胶质细胞FTO/m6A调控参与卒中后功能恢复。
图2｜PT小鼠不同细胞类型中的FTO基因表达及其对运动功能恢复的影响
FTO去甲基化促进circSCMH1生成
多组学分析发现，circSCMH1是卒中后表达下降、且受FTO调控的关键circRNA。FISH、qPCR和体外实验进一步证实，FTO过表达可提高circSCMH1水平，但不影响线性Scmh1 mRNA；缺失去甲基化活性的FTO则无法发挥作用。抑制m6A甲基化可增加circSCMH1，并逆转FTO敲低导致的circSCMH1下降，说明m6A甲基化会抑制circSCMH1生物发生，而FTO可通过去甲基化作用促进circSCMH1生成。
图3｜FTO 通过m6A修饰促进circSCMH1丰度增加
YTHDC1调控circSCMH1生成
研究团队通过单细胞测序、RIP和pull-down实验证实，YTHDC1是与circSCMH1结合最强的m6A阅读蛋白。进一步分析发现，circSCMH1含有一个在人和小鼠中保守的m6A修饰位点，突变该位点后，circSCMH1与YTHDC1的结合明显减弱。功能实验进一步显示，敲低YTHDC1会降低circSCMH1水平，而过表达YTHDC1可促进circSCMH1水平升高，且这一调控作用依赖YTHDC1的YTH结构域。上述结果表明，YTHDC1通过识别circSCMH1的特定m6A位点，参与其生成调控。
图4｜YTHDC1与circSCMH1的相互作用由m6A修饰介导
FTO/YTHDC1促进circSCMH1生成与核输出
单细胞测序显示，卒中后YTHDC1表达水平下降，而FTO过表达可上调小胶质细胞中的YTHDC1表达水平。机制上，FTO通过去除Ythdc1 mRNA 3’UTR区域的m6A修饰，增强YTHDC1表达并促进circSCMH1生成。尽管FTO也会降低circSCMH1本身的m6A修饰，但其上调YTHDC1的作用占主导。野生型circSCMH1可维持核内YTHDC1升高，而m6A位点突变后该调控环路无法持续。
研究发现，敲低YTHDC1会同时降低细胞核和细胞质中的circSCMH1水平，说明其可促进circSCMH1生成；而过表达YTHDC1后，细胞质circSCMH1增加、核内circSCMH1减少，提示其还参与circSCMH1核输出。进一步实验显示，FTO过表达也产生类似变化，说明m6A相关调控不仅影响 circSCMH1生成，也参与其从细胞核向细胞质转运。
图5｜YTHDC1促进circSCMH1的生成与核输出
Exportin-4介导circSCMH1核输出
研究团队在原代小胶质细胞中分别敲低Exportin-2和Exportin-4。结果显示，敲低Exportin-2对 circSCMH1的总量及细胞内分布均无明显影响；而敲低Exportin-4不改变circSCMH1总量，却显著减少细胞质中的circSCMH1，并增加核内circSCMH1。FISH实验进一步验证了这一结果，说明Exportin-4是介导circSCMH1从细胞核输出至细胞质的关键转运蛋白。
图6｜circSCMH1的核输出依赖Exportin-4
YTHDC1协同Exportin-4介导circSCMH1核输出
研究发现，敲低Exportin-4会减少细胞质中的 circSCMH1，并导致其在细胞核内积累；而同时过表达YTHDC1可部分逆转这一变化，说明二者协同调控circSCMH1核输出。机制上，YTHDC1可与Exportin-4直接结合，且这一结合依赖circSCMH1上的m6A修饰位点。进一步实验表明，YTHDC1是连接circSCMH1与Exportin-4的关键因子，可通过识别m6A修饰促进circSCMH1–YTHDC1–Exportin-4复合物形成，从而介导circSCMH1核输出。
图7｜YTHDC1与Exportin-4协同促进circSCMH1核输出
Exportin-4核输出维持脑修复
研究团队利用Exportin-4缺陷小鼠验证circSCMH1核输出对脑修复的作用。结果显示，Xpo4表达降低不影响circSCMH1总量，但会减少细胞质中的circSCMH1、增加核内circSCMH1，提示其核输出受阻。行为学实验进一步发现，+/−Xpo4小鼠卒中后感觉运动功能恢复较差，且外源circSCMH1难以有效改善其功能缺损。说明circSCMH1依赖Exportin-4 从细胞核输出至细胞质，才能维持外源给药诱导的持续脑修复效应。
图8｜circSCMH1核内积累导致神经运动功能障碍
总结
本研究揭示了单剂量外源circSCMH1促进卒中后持续脑修复的机制。外源circSCMH1可驱动内源性circSCMH1生成，并通过FTO/m6A/YTHDC1调控促进其生物发生；同时，YTHDC1与Exportin-4协同介导circSCMH1从细胞核输出至细胞质。FTO/m6A/YTHDC1/Exportin-4调控轴共同维持了circSCMH1的持续作用，为理解circRNA核酸治疗的长效机制及卒中后脑修复提供了新的依据。
原文链接：
https://academic.oup.com/brain/advance-article-abstract/doi/10.1093/brain/awag161/8671744?redirectedFrom=fulltext&login=false