环状RNA（circRNA）闭环结构可以免受核酸外切酶的降解，体现比线性mRNA更高的稳定性。目前RNA环化方法主要为化学合成法、T4连接酶法或核酶自剪接法。
其中，化学环化方法依赖于通过亚磷酰胺化学合成的短RNA前体序列，因此仅能合成较短的circRNA序列，临床应用前景有限。
近日，波兰华沙大学 Jacek Jemielity、Joanna Kowalska团队在Nat Commun上发表论文：Chemical circularization of in vitro transcribed RNA for exploring circular mRNA design。研究开发一种新的化学环化策略，可以环化不同长度（35- 4000 nt）的体外转录RNA，最大限度减少环化和功能化RNA所需的步骤。该方法环化效率高达60%，适用于各种序列并兼容RNA修饰，允许设计和合成帽依赖翻译的circRNA。研究合成的编码chem-circRNA体现卓越的蛋白表达能力和良好的生物相容性，可以用于获得治疗性的circRNA。
研究亮点
① 编码全长蛋白质mRNA的化学环化；
② IVT RNA的化学环化；
③ 帽依赖性翻译环状RNA的设计和环化；
④ m1Ψ修饰RNA的环化。
建立化学环化方法
研究基于PORA（高碘酸盐氧化和还原胺化）的直接和选择性化学反应，开发了化学环化RNA方法，以获得chem-circRNA。该反应的起始材料是在携带乙二胺（EDA）基序的转录引物存在下通过标准体外转录获得的RNA。PORA仅需简单试剂的一锅两步反应，不到2小时。
研究还设计了两种类型的含有不同长度EDA连接子的AG二核苷酸：EDA-AG（EDA）和EDA-PEG5-AG（EP5）；还设计了一种EDA功能化的cap 1类似物EDA-PEG5-m7GpppAmG（EP5Cap），以合成含内部5′帽结构的环状mRNA。
图1 RNA环化的策略。
优化长序列RNA的环化效率
研究证明了环化产率主要取决于RNA的局部二级结构（端到端距离），而不是其长度。该化学环化方法可以有效环化各种长度和序列的RNA，长达近4000 nt。
图2 RNA01（B）、RNA02（C）和RNA02二聚体（D）的最小自由能（MFE）二级结构（2D）模型（使用RNAfold网络服务器预测）和预测模型（RNA Composer网络服务器）的三级结构（3D）。
对于较长RNA和具有非结构化3′端的RNA（包含3′端polyA），环化效率降低，这可能是由于较高的构象灵活性。研究使用寡核苷酸DNA夹板，控制二级结构，实现了复杂大分子RNA的35%-60%环化效率，与T4 RNA连接酶II环化效率相当（40-60%）。
图3 可使用DNA夹板增强挑战性RNA序列的环化效率，并通过应用FRET探针和分子建模优化。
鉴定和分离chem-circRNA的分析方法
团队还研究了最佳凝胶密度和交联度的聚丙烯酰胺凝胶，以实现线性和环状RNA的最佳迁移和分离，可以实现高达4000 nt的线性和环状RNA的分离。高交联度和高凝胶密度可分离短RNA，而低密度和交联度的凝胶则不能分离短RNA。IP-RP-HPLC和PAGE结合可能可以提供精确分析环化反应和分离高纯度circRNA产物的工具。
验证化学修饰的circRNA的翻译
研究表明在chem-circRNA中添加m7G帽增加了其翻译活性，尽管该效应是序列依赖性的。chem-circRNA中的内环帽保持其功能性，使chem-circRNA可以进行帽依赖翻译，其蛋白质表达水平显著高于酶促环化的未加帽circRNA或IRES驱动翻译的circRNA。然而，优化帽依赖翻译的circRNA，总体翻译活性和持久性并不稳定，减少了circRNA相比mRNA的优势。
图4 含内部帽结构的chem-circRNA具有卓越的翻译活性。
此外，化学环化方法与m1Ψ等RNA碱基修饰兼容，而不影响chem-circRNA的翻译活性，突出了其在治疗应用中优化circRNA生物活性的潜力。
图5 含内部帽结构的chem-circRNA参与帽依赖性翻译。
验证chem-circRNA体内翻译活性
研究还制备了编码人促红细胞生成素（hEPO）的chem-circRNA，LNP包封后并注射到C57BL/6小鼠中，chem-circRNA的总蛋白质表达水平显著高于其线性对应物，证实了化学环化形成的核苷酸间连接的生物相容性。但总体蛋白质输出和翻译持久性相对较低，需要进一步优化chem-circRNA序列。
图6 编码人促红细胞生成素（hEPO）的化学环化RNA的体内翻译性。
总结
研究开发了一种基于高碘酸盐氧化和还原胺化的RNA化学环化方法（PORA），将circRNA设计边界拓宽到IRES依赖翻译之外（如帽依赖翻译）。
该策略基于经济实惠、容易获得的非侵入性试剂，可以应用于不同长度（长达4000nt）和序列的RNA。其产生的circRNA在细胞中进行相对稳定性和高活性的翻译。该环化方法还兼容化学修饰，如N7-甲基鸟苷帽和m1Ψ，有利于治疗性circRNA的进一步设计和优化。
团队还表示，另外关于m7G修饰环状RNA创建及其卓越翻译活性验证的研究也正在筹备发表中。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-025-61775-1