监测抗体水平对于诊断疾病、评估疫苗效力和了解免疫机制至关重要，定期检测血清抗体水平有利于防止疗效干扰和降低毒性风险。
Cas12a（Cpf1）因其独特的结构和功能特性而备受瞩目，它不仅可以切割高度特异性序列的双链DNA的能力（顺式切割活性），还能非选择性地切割单链 DNA（反式切割活性）。除了基因编辑能力外，CRISPR/Cas12a系统还能作为信号放大技术，广泛用于各种生物标志物的检测，如DNA、RNA、生物小分子甚至活细胞，具有理想的检测灵敏度和检测时间。
然而，CRISPR/Cas12a的灵敏度和复杂样品中的应用仍存在局限性，需要优化的策略，避免信号泄漏，提高检测灵敏度并降低背景信号。环状RNA可以作为CRISPR/Cas12a的crRNA（CcrRNA），其独特的闭环结构可以阻止Cas12a蛋白发挥作用，从而大大减弱了背景信号。此外，CcrRNA的高稳定性使其在复杂样品中不易降解，有助于确保检测结果的一致性和可靠性。
近日，重庆理工大学Fengfeng Xu和Wenjiao Zhou团队在Talanta期刊上发表了研究论文：Low-background CRISPR/Cas12a sensing system with circular CRISPR RNA for amplified fluorescent detection of antibody in human serum。研究构建了一种环状crRNA（CcrRNA）介导的新型低背景CRISPR/Cas12a传感系统，用于人血清中Anti-Dig抗体荧光信号放大检测。该系统可发展成为一种简单、灵敏、可靠的生物传感方法，并展现应用于临床诊断和生物医学研究的巨大潜力。
低背景传感系统作用原理
该检测系统在靶标抗体不存在的情况下，CcrRNA的拓扑结构可以有效抑制crRNA的正常功能，使其无法调节Cas12a系统的顺式/反式切割活性，有利于降低背景信号。
靶标Anti-Dig抗体存在的情况下，Anti-Dig抗体触发完全Mg2+依赖性MNAzyme的组装，并恢复其水解活性，从而允许MNAzyme识别并切割CcrRNA，形成线性的LcrRNA。LcrRNA激活CRISPR/Cas12a系统的反式切割活性，进一步循环切割大量的荧光报告基因单链DNA底物，产生持续放大的荧光信号，从而实现Anti-Dig的超敏检测。
图1 使用CcrRNA介导的CRISPR/Cas12a传感系统的抗体检测机制。
传感系统检测效果
该系统可在60分钟内灵敏检测低至15 pM的Anti-Dig抗体，线性检测范围为25 pM-50 nM。该系统对非靶标抗体表现出的优异选择性。此外，研究还证实了在稀释的血清样品中成功验证了该系统的适用性，回收率为96.16%至103.08%。这种CcrRNA介导的新颖CRISPR/Cas12a传感系统是一种强大而高效的工具，可用于检测复杂生物样品中的低丰度生物标志物。
表1 不同的荧光方法检测Anti-Dig抗体结果
总结
总之，研究基于CRISPR/Cas12a和MNAzyme的二次信号放大技术，构建了独特拓扑结构的CcrRNA介导的低背景CRISPR/Cas12a传感系统，用于灵敏、可靠地监测稀释的人血清中的Anti-Dig抗体，同时避免了使用耗时的信号扩增技术，如杂交链反应（HCR）、滚环扩增（RCA）和催化发夹自组装（CHA）。
此外，该方法中的二次信号放大策略也可应用于其他具有双识别位点的抗体，或具有双识别适配体的蛋白质，如Anti-DNP、Anti-HIV、Anti-cTnI等。随着便携式传感设备的开发，CcrRNA介导的新型CRISPR/Cas12a传感系统有望应用于高灵敏度和准确性的生物标志物临床检测。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0039914025002164?via%3Dihub