Mol Cancer丨西安交大新突破！孙欣博士团队发现circRNA在肺腺癌中的巨大潜力

随着新靶点的确定和治疗方法的不断完善，肺癌治疗领域取得了重大进展。特别是靶向治疗的出现，如酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)，因其能够改善反应且副作用更少而获得认可。尽管第三代TKIs Osimertinib在延长生存期和降低复发风险方面具有显著优势，但长期治疗的患者仍然会遇到耐药性和疾病进展。

环状RNA（circRNAs）是非编码RNA的一个亚类，其独特的环状结构使其在各种生物过程中具有多样化和持续的功能作用。虽然环状RNA参与癌症的发生、进展、耐药和复发已经被广泛研究，但它们在肺癌治疗中的具体作用，特别是它们与TKIs的相互作用，仍然知之甚少。

2023年7月1日，陕西省西安交通大学第一附属医院胸外科孙欣博士团队在Molecular Cancer（IF=37.3）发表文章Enhancement of TKI sensitivity in lung adenocarcinoma through m6A-dependent translational repression of Wnt signaling by circ-FBXW7。通过生信分析和阵列研究，作者发现circFBXW7在Osimertinib耐药细胞系中的表达显著降低，circFBXW7的异常表达决定细胞对Osimertinib的反应。circFBXW7抑制癌症干细胞的更新，并使耐药LUAD细胞和干细胞对Osimertinib重新敏感。机制方面，发现circFBXW7可以翻译成circFBXW7-185AA的短多肽，以依赖m6A的方式与β-catenin相互作用，并通过诱导随后的泛素化导致β-catenin稳定性降低，从而抑制Wnt信号的激活。作者预测m6A阅读器YTHDF3与hsa-Let-7d-5p具有共同的结合位点，强制表达Let-7d转录后降低了YTHDF3的水平。Wnt信号对Let-7d的抑制释放了YTHDF3对m6A修饰的刺激，促进了circFBXW7-185AA的翻译。这就产生了一个积极的反馈，促进了癌症的发生。

肺腺癌中Wnt信号激活导致较差的生存结果和TKI治疗耐药性

在肺癌组织中Wnt信号效应因子SOX和Snail家族的异常表达状态最为显著，作者利用RNA阵列和芯片序列检测到SOX家族的异常表达。为了测试Wnt信号在评估Osimertinib治疗效果中的作用，作者在ROC-Plotter相关的Dep-map计算中应用了KEGG通路评估，结果如图1D所示。显著表达的Wnt因子参考图1D的文本标签，差异表达最多的功能因子和配体列于图1E。作者应用Wnt信号基因簇预测TKIs治疗作用，发现Wnt通路异常激活与多种反应和长期治疗结果显著相关。

图1 Wnt信号表达状态特征及其临床意义

激活Wnt信号维持干细胞更新并促进TKI抗性

在恶性肿瘤中，一小群处于休眠状态的干细胞保持一致的沉默，直到被触发，释放出它们巨大的繁殖潜力。研究表明，与邻近的正常癌细胞相比，耐药的H1975OR细胞和HCC827OR细胞含有更多的干细胞。因此，作者开始寻找能够准确区分这组干细胞的潜在标记。其在HCC827和H1975细胞系中鉴定出表达CD133⁺/CD24⁻标记或ALDH1A1⁺标记的较小的干细胞样细胞组。此外，ALDH1A1⁺细胞表现出自我更新和形成球体的能力，并对2uM的Osimertinib治疗表现出固有的抗性。作者检查并证实了Wnt信号效应物在肺癌干细胞及耐药细胞中过表达。作者采用Capmatinib、TCF-4、SNAI1和SOX2抑制方法抑制Wnt功能，促进了对称细胞分化，减少了不对称和对称细胞的自我更新，极大地破坏了成球能力。

图2 干细胞保留再生能力，以Wnt激活依赖的方式重新产生肺癌组

TKI耐药肺癌细胞中失调环状RNA的特征

为了生成一个circRNAs分析数据库，并测试其翻译概率。作者对耐药的HCC827OR细胞和H1975OR细胞的rRNA去除后的总RNA进行了RNA-seq分析。进行多种功能分析发现，差异表达的circRNAs主要参与microRNAs功能和细胞分裂并导致耐药。发现由失调环状RNA驱动的分子功能和细胞成分被破坏，具有显著失调和潜在异常功能的候选环状RNA在图3F中展现。

图3 环状RNA参与Osimertinib治疗耐药

m6A介导circ-FBXW7表达促进干细胞的更新抑制

作者发现耐药细胞的总RNA的m6A水平比敏感的原始细胞更丰富，表明m6A参与了治疗耐药。采用Arraystar测序技术检测干细胞和邻近癌细胞之间每个环状RNA的m6A差异，将强m6A特征的失调环状RNA与图3A切片的筛选结果进行比较，选择hsa_circ_0001451进行研究。差异表达的hsa_circ_0001451(circ-FBXW7)在circRNA数据库中进行匹配，并评估其在耐药细胞中的表达模式。

为了进一步表征m6A在产生抗性中的不确定作用，作者通过慢病毒敲低YTHDF3，发现YTHDF3强烈影响circ-FBXW7水平，并通过免疫印迹和LC-MS/MS测试证实了这一点。为了验证m6A对干细胞的控制，作者发现抑制YTHDF3促进干细胞的增殖，证明了YTHDF3/m6A/circFBXW7的功能级联作用。

图4 耐药肺癌细胞中m6A修饰circ-FBXW7表达

m6A刺激circ-FBXW7-AA的翻译决定干细胞的分化

circ-FBXW7连接检测ORF和内部核糖体入口位点(IRES)的探针，启动独立翻译。FLAG抗体在293 T细胞中验证Circ-FBXW7-AA上调。作者发现，m6A影响circ-FBXW7-185AA的翻译效率，其中YTHDF3决定环状RNA的表达和AA肽水平，抑制阅读器YTHDF3显著降低了circFBXW7-185AA的表达。过表达circ-FBXW7抑制干细胞组的增殖，抑制YTHDF3不能刺激circ-FBXW7依赖性分化细胞的分化。

抑癌基因和致癌基因的不配对分布最终导致子细胞具有不同的特征，为了证明子细胞的不同特征，作者通过研究发现，circ-FBXW7阴性的细胞）（circ-/H3K27me3⁺/ALDH1A1⁺）显示出更高的球体形成能力；与阳性对照组和具有阴性circ-FBXW7和阳性H3K27me3/ALDH1A1标记的细胞相比，具有circ-FBXW7⁺/H3K27me3^–/ALDH1A1^–表型标记的阳性组的球体形成能力大大下降。增强circ-FBXW7刺激对称分化分裂，从而导致球体形成受到抑制，并影响肿瘤的形成。

过表达circ-FBXW7影响Wnt/β-catenin通路的下游信号传导，从而抑制更新。CO-IP实验表明，HCC827和H1975细胞中circ-FBXW7-185AA与β-catenin相互作用。circ-FBXW7-185AA的多肽可能以翻译后调节的方式调节β-catenin；作者通过环己胺（CHX）试验发现，circ-FBXW7-185AA对β-catenin的蛋白稳定性有负调节作用。β-catenin的泛素化对Wnt/β-catenin的传导功能稳定性起着重要作用，β-catenin的泛素化水平随着过表达circ-FBXW7-185AA逐渐增加，而加入MG132又削弱了circFBXW7-185AA对β-catenin表达的抑制作用。

图5 翻译后的circ-FBXW7以β-catenin泛素化的方式抑制干细胞更新

circ-FBXW7抑制Wnt/β-catenin信号激活，释放Let-7d形成正向信号回路

作者推测circ-FBXW7和let-7家族miRNAs之间的潜在联系可能在干细胞的更新和治疗耐药中具有重要价值。首先证实circ-FBXW7显著刺激Let-7d，并且在耐Osimertinib的HCC827OR和H1975OR细胞中Wnt信号抑制并释放Let-7d表达。抑制β-catenin强烈刺激Let-7d的表达，circ-FBXW7、si-β-catenin或联合使用组之间的差异不明显，表明它们的功能相似。

为了进一步阐明Let-7d相关调控机制，作者对相关数据库进行筛选，在YTHDF3和Let-7 miRNAs的m6A阅读器中找到预测的结合位点。当改变Let-7b/d/i时，YTHDF3 mRNA没有明显变化；但当引入Let-7d时，蛋白质水平大大降低。增强Let-7d抑制野生型YTHDF3 mRNA的荧光素酶活性，但在突变组中不起作用。研究结果表明，增强Let-7d可以以依赖YTHDF3抑制的方式抑制circ-FBXW7的表达，形成一个负反馈回路。综上，无论是增强circ-FBXW7，增强Let-7d，还是抑制YTHDF3，都能降低H1975OR和HCC827OR耐药细胞的自我更新能力，并缩小带有ALDH1A1表面标记的干细胞群。

图6 circ-FBXW7通过Wnt/β-catenin信号调控形成负反馈发挥作用

小结

作者研究表明，circFBXW7通过作用于β-catenin泛素化和抑制来调节Wnt通路功能，从而有效抑制LUAD干细胞的能力和逆转TKIs的耐药性。m6A通过影响干细胞群中circRNA的环化和翻译，在维持耐药状态中起着至关重要的作用。这种机制有效地将不断更新的干细胞推向临床治疗的前沿，在增强治疗策略和克服多种TKI治疗耐药方面具有巨大潜力。

原文链接：

https://doi.org/10.1186/s12943-023-01811-0