结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。临床上,近一半的CRC患者中发生癌转移,致使死亡率较高[1]。因此,迫切需要更有效的诊疗策略以及精准医疗,在分子水平上分析结直肠癌发生、发展、侵袭、转移和复发的机制。

环状RNA(circRNAs)是一类新型的非编码RNA,通过在5端和3端之间的共价连接形成闭环,circRNAs可以作为miRNAs海绵,与RNA结合蛋白相互作用,调节mRNA的稳定性,参与基因转录和蛋白质翻译[2]。鉴于circRNA的特点,其可能在某些疾病,特别是癌症中发挥新型分子标记的作用,实际上在不同类型的癌症中都有报道,包括胃癌、乳腺癌、CRC和肝细胞癌等。

2023年1月,广州南方医科大学南方医院李婷婷教授Cell Death & Disease发表文章:CircIFNGR2 enhances proliferation and migration of CRC and induces cetuximab resistance by indirectly targeting KRAS via sponging to MiR-30b。文章介绍,CRC是世界上最常见的恶性肿瘤,并显示出西妥昔单抗耐药性。而作者发现,circIFNGR2在转录后通过海绵miR-30b间接调控靶基因KRAS,诱导结直肠癌细胞对西妥昔单抗的耐药。本研究提示,抑制circIFNGR2可能是抑制恶性CRC患者西妥昔单耐药的一种治疗策略。

1、circIFNGR2在结直肠癌中表达上调 

首先作者试验验证,circIFNGR2是反向剪切形成。并且,与正常组织相比,CRC肿瘤组织circIFNGR2表达显著升高;而CRC癌旁组织和CRC组织关于circIFNGR2的qPCR结果与此一致。

 图1. circIFNGR2在结直肠癌中表达上调

 

2、circIFNGR2正向调控CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力 

作者分别设计过表达和敲低circIFNGR2,无论是在离体的CRC细胞系中,还是在在体的小鼠模型中,验证circIFNGR2对于CRC细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果发现,circIFNGR2在CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力中具有显著的正向调控作用

图2. circIFNGR2促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭

 

3、circIFNGR2海绵抑制miR-30b的转录调节活性  

作者使用starBase网站,预测circ_IFNGR2可以与miR-30b结合。随后作者分别构建野生型和突变型载体,通过荧光素酶报告基因实验验证circ_IFNGR2与miR-30b存在结合;FISH实验结果也显示circIFNGR2和miR-30b在细胞质中明显共定位。此外,RNA pulldown实验证明,靶向circIFNGR2的生物素化探针可以同时下拉HCT8和CACO2细胞中的miR-30b。RIP结果显示,在过表达miR-30b的细胞中,被anti-Ago2靶向miR-30b拉低的circIFNGR2显著富集。上述实验均证明,circIFNGR2与miR-30b的直接结合,并能够反向调控miR-30b

鉴于miR-30b在CRC中作为抑癌基因发挥作用,作者接下来进行了一系列细胞功能测定,以探索miR-30b是否可以逆转circIFNGR2对CRC细胞功能的影响。正如预期的那样,无论是在体实验还是离体实验,均证明,miR-30b对CRC细胞侵袭和增殖凋亡能力的影响同circIFNGR2相反,并且circIFNGR2的加入,能够逆转miR-30b对CRC细胞的作用。综上所述,circIFNGR2可以通过靶向miR-30b在体内和体外影响CRC细胞的功能

图3. circIFNGR2海绵抑制miR-30b的转录调节活性

 

4、circIFNGR2通过靶向miR-30b影响KRAS表达 

KRAS可以通过激活下游AKT信号促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。circIFNGR2可增加CRC细胞中KRAS的mRNA水平。Western blotting检测相应KRAS下游信号蛋白如p-ERK和p-AKT的蛋白表达水平发现,circIFNGR2过表达促进p-ERK和p-AKT蛋白表达水平上调。此外,在WT-KRAS CRC患者中,circIFNGR2可上调KRAS的表达,激活下游AKT信号通路,促进CRC细胞对西妥昔单抗的耐药

作者进一步验证了circIFNGR2、miR-30b和KRAS之间的关系。结果显示,内源性miR-30b被靶向KRAS的生物素标记探针拉低。在HCT8和CACO2细胞中进行的Anti-Ago2 RIP实验显示,抗ago2对miR-30b的抑制作用下,KRAS大量富集。提示miR-30b可下调KRAS的表达。然而,在CRC细胞中转染circIFNGR2逆转了KRAS的下调。相反,在circIFNGR2过表达组中,加入miR-30b则降低了KRAS的水平。综上所述,虽然miR-30b可以下调KRAS的表达,但circIFNGR2可以逆转miR-30b下调KRAS的作用

图4. circIFNGR2通过靶向miR-30b影响KRAS的表达

 

5、circIFNGR2在CRC细胞中诱导西妥昔单抗疗耐药 

西妥昔单抗可诱导肿瘤细胞凋亡,从基因水平抑制细胞过程,也可与NK细胞等效应细胞的Fc片段受体结合,通过抗体依赖细胞细胞毒性杀伤肿瘤细胞。

考虑到circIFNGR2有助于CRC中癌细胞的特性,作者接下来研究circIFNGR2是否导致西妥昔单抗治疗耐药。CCK8、transwell和集散形成实验显示circIFNGR2增强了CRC细胞的增殖和迁移能力。然而,西妥昔单抗治疗后,对照CRC细胞的增殖和迁移能力下降,而circIFNGR2过表达的CRC细胞的增殖和迁移能力未下降。这提示,circIFNGR2过表达可促进西妥昔单抗化疗耐药性。CRC细胞创面愈合试验的统计分析表明,西妥昔单抗处理后,未转染circIFNGR2的细胞迁移能力明显降低,而circIFNGR2过表达组细胞迁移能力无明显影响;流式细胞仪检测凋亡的结果也与此一致。体内裸鼠异种实验也进一步印证了circIFNGR2在西妥昔单抗耐药中的作用。综上所述,circIFNGR2通过靶向KRAS诱导CRC细胞对西妥昔单抗的耐药

 

图5. circIFNGR2在CRC细胞中诱导西妥昔单抗治疗耐药

 

原文链接:

https://doi.org/10.1038/s41419-022-05536-8

参考文献:

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin.2020;70:7–30.

[2] Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet.2019;20:675–91.

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