月初Oncogene杂志接收了中南大学药学院朱曲波副教授的一篇名为CPSF4 regulates circRNA formation and microRNA mediated gene silencing in hepatocellular carcinoma的论文。
在肿瘤研究中，针对circRNA随细胞增殖被动分散的观点，作者预想肝癌（Hepatocellular Harcinoma，HCC)细胞中的circRNA主动减少。尽管circRNA的反向剪切不同于线性RNA的剪切过程，但是二者具有相同的剪切因子和成熟因子（snRNAs，蛋白复合物）。因此，调控pre-mRNA的可变剪切（AS）和选择性聚腺苷酸化（APA）的顺式和反式作用元件也会影响RNA的成环。随着近年来蛋白-RNA关系的探究，发现3’端的形成因子（CPSF，CSTF，CFIm，CFIIm）在AS过程中发挥重要作用。2018年8月Oncogene刊登了朱老师课题组的一篇文章，NUDT21 negatively regulates PSMB2 and CXXC5 by alternative polyadenylation and contributes to hepatocellular carcinoma suppression，研究发现CFIm的亚基NUDT21通过影响APA进而抑制HCC的发生，为APA机制研究在HCC中的应用提供了新的视角。因此，作者猜想结合聚腺苷酸化信号序列（PAS，AAUAAA等）的核心因子CPSF同样对HCC的发生具有重要作用。前期研究发现CPSF的亚基CPSF4在HCC患者中表达上调，且与HCC患者预后不良相关。进一步研究发现CPSF4降低环状RNA水平，减少与circRNA结合的miRNA的积累，进一步抑制miRNA介导的肝癌基因的沉默，发挥促癌基因的作用。
技术路线：
（作者在课题进展过程中，大量从数据库挖掘有利信息，通过实验验证猜想。）
1、CPSF4高表达与HCC患者预后不良相关
查阅TCGA数据库，分析50组HCC组织和癌旁组织中CPSF4的表达，发现CPSF4 mRNA在HCC组织中的表达显著性高于癌旁组织。同时作者查阅GEO数据库对10名肝癌患者外周血单个核细胞(PBMC)样本和10名健康对照者PBMC样本进行微阵列分析，发现HCC患者PBMC样本中的CPSF4水平显著高于10名健康对照者。说明CPSF4是一种适合HCC诊断的生物标志物。在GAPIA数据库生成对182名高表达CPSF4和182名低表达CPSF4的HCC患者进行生存分析，发现高表达CPSF4的HCC患者的生存率明显较差。随后逻辑相关性分析发现CPSF4水平与患者的临床病理特征显著性相关，同时经过单因素和多因素相关性分析发现CPSF4是生存率的独立预后因素。
为了进一步验证生信分析结果，作者分别对5组HCC组织和癌旁组织，以及5个HCC细胞系和正常肝脏细胞进行CPSF4蛋白的WB检测，发现CPSF4在HCC组织和HCC细胞系中均有高表达。随后对HCC组织进行IHC染色，在组织学水平验证CDSF4在HCC组织中高表达。随后通过卡方检验进行相关性分析，发现CPSF4表达水平高预示患者预后不良。
图1 CPSF4在HCC组织中高表达，CPSF4高表达提示肝癌患者预后不良。
2、CPSF4降低HCC细胞中circRNA的水平
作者对HepG2细胞进行CPSF4的敲低处理，对Bel7402细胞进行CPSF4的过表达处理，分别提取两组细胞及其相应阴性对照组细胞的全基因组RNA，进行高通量测序。发现CPSF4-OE细胞中表达下调的circRNA的数量和整体circRNA水平显著降低，CPSF4-KD细胞中表达上调的circRNA数量和整体circRNA水平显著升高。两组实验细胞与对照组相比较，circRNA的长度没有发生变化。而CPSF4调控后circRNA的变化是PAS依赖的。对四组细胞中circRNA的表达水平进行统计分析，显示CPSF4改变后的circRNA变化依赖于PAS序列，CPSF4敲低会影响含有PAS元件细胞的circRNA，而CPSF4敲低不影响不含PAS元件细胞的circRNA，CPSF4过表达对含有以及不含PAS元件细胞的circRNA均有影响。为验证测序结果，将GEO数据库筛选出的HCC组织中下调的circRNA分子与测序结果中CPSF4-OE细胞中下调和CPSF4-KD细胞中上调的circRNA交集筛选出在3组数据中均存在的24个cirRNA，使用qRT-PCR检测细胞中circRNA的表达。通过构建敲低和过表达载体对生信分析结果进行验证，说明CPSF4在转录后抑制了circRNA的表达。
图2 CPSF4减少HCC细胞中circRNA的生物发生
3、PAS序列的功能
作者在IRES前插入AAUAAA序列，构建不同于亲本质粒的mutated circ-GFP质粒，使用激光共聚焦验证转染亲本和突变体质粒的HCC细胞的荧光强度。使用FISH探针标记siCPSF4，随后对HCC细胞进行荧光染色，发现CPSF4沉默促进了表达AAUAAA序列的circ-GFP的生物发生。使用qRT-PCR和WB从RNA和蛋白水平进行验证。
图3 PAS序列对CPSF4介导的RNA环化至关重要
4、CPSF4和miRNA的关系
作者使用生物分析仪对处理后的细胞进行小RNA分析，发现miRNA在CPSF4- KD细胞中的比例升高，在CPSF4- OE细胞中的比例降低，证实了CPSF4可以减少miRNA的积累。作者在补充数据中提到通过查阅TCGA数据库进行生信分析，在HCC组织中miRNAs水平整体下调。使用CircInteractome数据库对circRNA–miRNA结合位点进行分析，筛选出了4个miRNA分子。随后在补充试验中使用pull down和RIP实验对选取的miRNA进行验证，通过双荧光素酶实验预测下游靶基因。使用WB分别检测CPSF4-KD和CPSF4-OE细胞中靶基因的蛋白表达水平，发现CPSF4-KD组下游基因蛋白表达量降低，CPSF4-OE组的下游基因蛋白表达量增加。
图4 CPSF4减少了miRNA的积累和基因沉默
5、CPSF4功能验证
为进一步探究CPSF4对HCC进展的影响。使用MTT实验和集落形成实验分别检测过表达CPSF4和敲低CPSF4对于HCC细胞增殖和集落形成的影响，发现过表达CPSF4可以显著性促进HCC细胞的增殖和集落形成。为进一步探讨CPSF4在体内实验中的作用，使用CPSF4敲低的HCC细胞进行皮下肿瘤异种移植，发现CPSF4-KD组肿瘤的直径，体积和重量均低于对照组。使用qRT-PCR验证发现敲低CPSF4后促进了组织内的hsa_circ_0004913，hsa_circ_0027774及其结合miRNA(hsa-miR145和hsa-miR-383)的表达。IHC染色发现敲低CPSF4后miRNA的下游靶基因表达蛋白量降低。这些结果证实CPSF4扰乱了circRNA/miRNA通路，并在肝癌的肿瘤发生中发挥了重要作用。
图5 CPSF4能促进肝癌细胞的增殖和致瘤性
6、CPSF4发挥促癌作用的机制探索与验证
分别构建hsa_circ_0004913过表达和hsa_circ_0004913/ CPSF4双过表达的稳转株细胞。使用MTT和集落形成实验分别检测过表达hsa_circ_0004913和hsa_circ_0004913/ CPSF4双过表达对HCC增殖和集落形成的影响，发现过表达hsa_circ_0004913可以抑制HCC细胞的增殖和集落形成，而过表达CPSF4可以抵消hsa_circ_0004913的抑癌作用进而促进HCC细胞的增殖和集落形成。
图6 CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的抑瘤作用
7、CPSF4调控circRNA的生物发生示意图
在pre-mRNA的转录调控过程中，CPSF参与3’-UTR区域的AS和APA过程，调控可变剪切的发生。过表达HCC细胞的CPSF4，增强其对circRNA中PAS原件的识别，促进CPSF复合物对circRNA的裂解，circRNA表达的减少会增加核酸酶对游离miRNA的降解。这样会导致一些致癌基因逃避了miRNA调控，最终导致肿瘤不受控制的增长。
图7 CPSF4调控circRNA生物合成，导致miRNA的降解
8、总结讨论
文章对大量数据库中的肝癌数据进行生信分析。发现HCC患者circRNA低表达，CPSF4高表达与患者的预后不良相关。随后通过细胞学实验验证CPSF4降低HCC细胞中的circRNA的水平。使用荧光表达质粒载体发现PAS序列对CPSF4介导的RNA环化至关重要。通过生信分析和实验验证发现CPSF4可能通过hsa_circ_0004913/hsa-miR-383-5p/PARP2和hsa_circ_0027774/hsa-miR-145-5p/CDCA3两条通路发挥生物学功能。随后分别在体内和体外对CPSF4的致瘤性进行验证。Hsa_circ_0004913已被报道是一种潜在的HCC抑制因子，进一步探讨CPSF4/hsa_circ_0004913/hsa-miR-383-5p/PARP2通路在HCC发生中的作用，构建hsa_circ_0004913和hsa_circ_0004913/ CPSF4过表达稳转株，研究HCC细胞的增殖和成团能力以及CPSF4发挥促癌作用的机制。综上所述，通过上调CPSF4在HCC细胞中的表达抑制circRNA的形成，海绵circRNA长时间缺失时miRNA被核酸酶降解，通过规避miRNA介导的基因沉默，相应肝癌基因的表达增加。
参考文献
1. Xueying Wang, Jiani Dong, Xiaojing Li, Zeneng Cheng, Qubo Zhu. CPSF4 regulates circRNA formation and microRNA mediated gene silencing in hepatocellular carcinoma. Oncogene. https://doi.org/10.1038/s41388-021-01867-6
2. Sheng Tan, Hua Li, Weijie Zhang, Yunying Shao, Yuan Liu, Haiyang Guan, Jun Wu, Yani Kang, Junsong Zhao, Qing Yu, Yunzhao Gu, Keshuo Ding, Min Zhang, Wenchang Qian, Yong Zhu, Huayong Cai, Changyu Chen, Peter E Lobie, Xiaodong Zhao, Jielin Sun, Tao Zhu. NUDT21 negatively regulates PSMB2 and CXXC5 by alternative polyadenylation and contributes to hepatocellular carcinoma suppression. Oncogene. 2018 Aug 37(35):4887-4900. doi: 10.1038/s41388-018-0280-6.