12月14日，Molecular Cancer发表重要综述，系统汇总了circRNA代谢，功能和蛋白互作的进展。文章的通讯作者是中山大学附属肿瘤医院徐瑞华教授和鞠怀强教授。
摘要
环状RNA（CircRNA）是单链共价闭合的RNA分子，广泛存在于各物种。近几年关于环状RNA的生成、调控、定位、降解和修饰等方面取得了重要进展。此外，环状RNA可作为转录调控因子、microRNA海绵和蛋白翻译模板发挥生物学功能。然而，现有的关于环状RNA与蛋白相互作用的研究相当有限。因此，本文简要归纳了关于环状RNA代谢和功能的最新进展，并详细讨论了环状RNA与蛋白相互作用的模式，主要包括以下五类：改变蛋白间的相互作用，拴住或隔离蛋白，募集蛋白到染色质，形成环状RNA-蛋白-mRNA三元复合体，以及蛋白转位或重分布。环状RNA具有独特的表达谱，并在多种疾病中发挥关键作用，这使其成为潜在的诊断标志物和治疗靶点。本文期望通过对环状RNA与蛋白相互作用机制的总结，促进基于环状RNA的转化医学的发展。
前言
环状RNA于1976年作为植物类病毒被首次发现。随着高通量RNA测序技术和生物信息学的发展，人们发现环状RNA是人类转录组的普遍特征，也广泛存在于众多其他物种。大量研究表明它们在多种疾病中具有独特表达谱和重要生物学功能，如肿瘤、心血管病、神经疾病和自身免疫病。然而目前其作用机制还不完全清楚，并且大多涉及其充当microRNA海绵发挥效应。小脑变性相关蛋白1反义链（CDR1as）是最早的代表分子。但最近的两项研究发现CDR1as也可以与蛋白相互作用（IGF2BP3，p53），这提示了环状RNA的多效性，同一分子可能通过多种机制发挥功能。蛋白是几乎所有生命活动的直接效应分子，与蛋白互作赋予了环状RNA丰富的可能性，并扩展了非编码领域的研究方向。因此本文整理分析了环状RNA与蛋白相互作用的模式并进行展望。
环状RNA代谢
人们关于环状RNA的上游代谢（生成、调控、定位、降解）及修饰依然了解较少（图1）。RNA聚合酶II所转录的前体mRNA由内含子和外显子组成，在剪接体的协助下，前体mRNA在经典剪接位点（5’GU，3’AG）进行剪接，从而成熟并可被翻译。环状RNA则是通过一种特殊的选择性剪接产生（反向剪接，back-splicing），即外显子的3’端通过3’, 5’磷酸二酯键与其自身或上游外显子的5’端连接，形成闭环结构。根据剪接事件的次序和不同的中间体，两种模型被提出并得到验证：套索模型和直接反向剪接模型（图1）。环状RNA的生成依赖于经典剪接体系（剪接位点和剪接体），并与其同源线性转录本间存在竞争。顺式元件（内含子互补序列）和反式因子（RNA结合蛋白）参与调控其生成。两侧内含子中的反向重复序列Alu可促进中间的外显子环化，而同一内含子中的Alu则促进其自身挤出和经典剪接的发生。此外，RNA结合蛋白可通过稳定/破坏Alu元件或直接拉近侧翼内含子实现调控。关于环状RNA的出核转运及降解机制，最近的一些研究也提供了曙光（图1）。值得注意的是，环状RNA还可以通过外泌体进入胞外空间，这提示了它可能作为细胞交流的信号分子，也展现了其作为诊断标志物的巨大潜力。
图1 环状RNA的代谢
环状RNA的调控：RBP可通过二聚化、稳定或破坏ICS来调控环状RNA生成。内含子两侧的ICS可以促进外显子环化。环状RNA的生成：A. 套索模型，反向剪接的外显子被跳过并挤出，形成内含子套索，套索再进一步被剪接，而其余的外显子直接互连形成成熟的mRNA。B. 直接反向剪接模型，反向剪接首先发生形成环状RNA，留下一条仍含有内含子的不成熟的线性RNA。环状RNA的转运：C. 在UAP56或URH49的协助下，长（>800nt）或短的环状RNA出核。D. YTHDC1介导的m6A依赖的环状RNA出核。E. 环状RNA经外泌体进入胞外空间。环状RNA的降解：F. 病毒感染后，2’-5’-寡聚腺苷酸活化的RNase L引起环状RNA的普遍降解，从而解除对PKR的抑制。G. YTHDF2识别含有m6A的环状RNA，并通过HRSP12桥接与RNase P/MRP复合体互作，介导环状RNA的酶切降解。H. UPF1和G3BP1可结合环状RNA的发夹样结构域并诱导其降解。
环状RNA功能
那么环状RNA是如何在分子水平上发挥作用的？其潜在机制主要涉及与其他分子的相互作用（图2）。长期以来它被认为是具有调节效应的“非编码”RNA，但随后科学家们鉴定出大量可翻译的环状RNA。尽管目前关于其下游途径的研究大多与microRNA海绵（也即环状RNA通过吸附microRNA，使得microRNA的靶mRNA上调）有关，但一些其他的机制也逐渐引起重视。如CircSEP3和CircSMARCA5可通过形成R环调控母基因的转录过程。外显子间含有内含子的环状RNA（EIciRNAs）以及环状内含子RNA（CiRNAs）也可调控其母基因的表达。环状RNA与其他分子（包括microRNA和蛋白等）之间的化学计量关系也受到了越来越多的关注。环状RNA在丰度普遍较低，结合位点数量有限的情况下，如何发挥出足够的（可检测的）效应尚不清楚。至于环状RNA的翻译，由于其缺乏5’帽和3’尾，故只能采取不依赖帽的翻译方式：由m6A或内部核糖体进入位点（IRES）介导。而环状RNA编码的多肽通常是截短的，但其功能大多类似于全长蛋白；然而，少数截短肽发挥的功能独立于甚至拮抗其母基因产物。
图2 环状RNA的功能
A. 环状RNA可以通过RNA-DNA杂交（R环）与其在母基因上的合成位点结合，导致转录暂停或终止，从而上调外显子跳过或截短的转录本。B. EIciRNAs可以与U1 snRNP结合，然后与Pol II相互作用，增强母基因的表达。C. 环状RNA可作为microRNA海绵，上调其靶mRNA。D. 环状RNA可以与蛋白相互作用。E. 含有IRES的环状RNA可以直接招募核糖体并被翻译。F. 含有m6A的环状RNA可以被YTHDF3识别并招募eIF4G2，从而介导翻译。这一过程可被METTL3/14增强，被FTO抑制。
环状RNA与蛋白相互作用
近年来部分研究发现环状RNA可通过与蛋白相互作用来发挥功能。我们将其分为五个部分（图3）来阐述。
图3 环状RNA-蛋白相互作用
A. (a)环状RNA与两种蛋白结合并增强它们的互作。(b)环状RNA与蛋白A结合，并增强（或解离）其与蛋白B的互作，而蛋白B不直接与环状RNA结合。(c)环状RNA与最初互作的两种蛋白结合，然后破坏它们的相互作用。B. 环状RNA阻止蛋白与DNA、RNA或其他蛋白互作。C. 环状RNA招募转录因子、染色质重塑因子和DNA或组蛋白修饰酶到染色质，改变转录(包括激活和抑制)。D. 环状RNA协助RNA结合蛋白与mRNA结合，稳定mRNA（间接调控翻译）或直接调控翻译。E. (a)核环状RNA导致蛋白的核滞留；(b)胞质或穿梭性环状RNA促进蛋白入核；(c)胞质环状RNA导致蛋白的胞质滞留；(d)核或穿梭性环状RNA促进蛋白出核。(e-g)此外，环状RNA可以将蛋白分别运输到核仁、线粒体和细胞膜。
（1） 改变蛋白间的相互作用
在这一部分中，我们总结了三种环状RNA-蛋白相互作用的模式：
①一个环状RNA与两种蛋白结合，并促进它们的相互作用；
②一个环状RNA与蛋白A结合，增强或解离其与蛋白B的相互作用（蛋白B不直接与环状RNA互作）；
③一个环状RNA与两种蛋白结合，解离它们的相互作用。
三种模式中都形成了环状RNA-蛋白A/B三元（或以上）复合体，但作用不同。
①：增强蛋白互作
在第一种模式中，环状RNA主要介导由蛋白B催化的蛋白A翻译后修饰（泛素化和磷酸化）或蛋白B对蛋白A的反式激活，从而触发下游级联反应。沉默CircFoxo3可增强细胞存活，而过表达它则会促进凋亡。机制上，CircFoxo3与p53和MDM2相互作用，促进p53的泛素化。同时由于MDM2被占据，从而缓解了Foxo3的泛素化。此外，CircFoxo3还与细胞周期相关。CircFoxo3-p21-CDK2三元复合体增强了CDK2与p21的相互作用并抑制了CDK2的磷酸化活性。这阻碍了CDK2/Cyclin E和CDK2/Cyclin A复合体的形成，从而分别阻断了G1/S转变和S期进程，导致细胞周期停滞于G1期。这也是首个发现环状RNA调控两个蛋白相互作用的研究。该模式的其他例子，如CircNfix、CircADD3、CircAmotl1和CircGLI1列举在表1。而CircCTNNB1和CircCUX1则是通过介导蛋白相互作用来调控反式激活。一项杰出的研究表明，在应对血清剥夺的代谢适应中，乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）前体mRNA的从产生线性转录本转变为产生环状ACC1。而CircACC1通过与AMPK的调节性β和γ亚基结合并增强它们的互作，促进AMPK全酶的组装、稳定和激活。随后通过AMPK抑制合成代谢，促进分解代谢，从而促进β氧化和糖酵解。然而ACC1前体mRNA为何从线性产物转变为环状产物仍不清楚。
第二种模式可以由CircCcnb1佐证。在p53野生型细胞中，CircCcnb1可通过H2AX拉下p53；而在p53突变型细胞中，CircCcnb1则通过H2AX拉下Bclaf1。值得注意的是，CircCcnb1不能直接结合p53或Bclaf1。由于野生型p53比起Bclaf1对H2AX亲和力更强，而CircCcnb1进一步增强了这种相互作用，因此CircCcnb1-H2AX-p53三元复合体释放出Bclaf1，可与Bcl2结合并增强细胞存活。而突变型p53不能与H2AX结合，因此CircCcnb1-H2AX- Bclaf1复合体束缚住Bclaf1，不能与Bcl2结合，因此诱导细胞凋亡。
②：解离蛋白互作
除了H2AX外，CircCcnb1还可以同时与Ccnb1和CDK1相互作用，形成一个大的三元复合体来解离蛋白互作，并限制它们入核，从而阻断Ccnb1的功能，减慢细胞周期。至于环状RNA与蛋白A结合并阻断其与蛋白B的相互作用（蛋白B不与环状RNA结合）的情况被归入第二种模式的第三类。
由此，我们看到了环状RNA和两种蛋白之间关系的多样性，并可以预见当涉及更多蛋白时情况的复杂性。然而，除了相互结合的位点或序列外，人们对于环状RNA如何改变蛋白互作知之甚少。我们推测环状RNA可能改变了蛋白的空间距离，暴露或掩盖它们的活性位点，或改变了它们的构象（别构激活/抑制）等。我们需要更多的研究和新的技术来验证这些。
（2） 拴住或隔离蛋白
在这一部分中，环状RNA只与一种蛋白结合，妨碍其原有功能或产生新的效应。根据下游分子我们将相关研究分为三类：环状RNA阻断蛋白与DNA、RNA或其他蛋白互作。
①：阻断蛋白与DNA互作
第一种类型中，DNA结合蛋白（如转录因子）最具代表性，这使得环状RNA对转录产生反效应。CircHuR通过阻断CNBP与HuR启动子结合，抑制HuR的转录，从而抑制胃癌的增殖、侵袭和转移。同样地，CircSCMH1通过阻断MeCP2，干扰其转录抑制效应，从而改善神经元的可塑性，抑制卒中后的胶质激活和免疫浸润。CircSamd4和ACR也符合这种类型。环化GMP-AMP（cGAMP）合成酶（cGAS）是一种DNA感受器，当cGAS与DNA结合时可催化cGAMP的合成。随后cGAMP激活STING通路，增加I型干扰素的表达。这是一种抵御微生物的防御机制，而被自身DNA激活的cGAS则会触发自身免疫。一般情况下，拮抗cGAS的环状RNA分子（cia-cGAS）可结合cGAS，避免其与自身DNA结合并抑制其合酶活性，从而消除cGAS介导的I型干扰素的产生，维持长期造血干细胞的稳态。
②：阻断蛋白与RNA互作
第二种类型中，调控mRNA剪接、稳定和翻译的RNA结合蛋白是主要靶点，使得环状RNA间接参与转录后调控过程。CircSMARCA5可通过隔离SRSF1抑制多形性胶质母细胞瘤的迁移。SRSF1可促进SRSF3前体mRNA外显子4的跳过。SRSF1和SRSF3（不含外显子4）均可上调PTBP1的表达，而PTBP1可促进胶质瘤细胞的迁移和黏附。VEGFA 的前体mRNA也可以被SRSF1选择性剪接，其异常剪接会导致促进/拮抗血管生成亚型的比例发生改变。除了干扰剪接因子，CircPABPN1可以隔离HuR，从而降低PABPN1 mRNA的稳定性，下调PABPN1并抑制HeLa细胞的增殖。其他例子还包括CircZKSCAN1、CircMTO1、CircMMP9和CircPPM1F。特别的是，CircANRIL与核仁蛋白PES1具有很强的相互作用。通过占据PES1的C端赖氨酸富含结构域，CircANRIL可阻止核酸外切酶介导的前体rRNA成熟，妨碍核糖体的合成和组装，导致核仁应激，使得p53被激活并在核内聚集，从而诱导动脉粥样硬化斑块中的细胞凋亡。
③：阻断蛋白与其他蛋白互作
第三种类型与第一种模式中的“解离蛋白互作”有相似之处。例如，CircGSK3β通过减少GSK3β对β-catenin的磷酸化及随后的泛素化促进食管癌的迁移和侵袭。CDR1as可以阻断p53与MDM2结合，从而减少p53泛素化，保护细胞免受DNA损伤。类似的例子包括Circ102171、CircH19和CircECE1。最近，关于线粒体基因组编码的环状RNA的突破性研究表明，脂肪性肝炎相关环状RNA ATP5B调节因子（SCAR）可与线粒体通透性转换孔（mPTP）复合体中的ATP合酶亚单位b（ATP5B）结合，阻断mPTP与CypD的结合，从而关闭mPTP，抑制线粒体ROS的产生和成纤维细胞的激活。
然而，目前大多数研究只观察到了环状RNA隔离蛋白产生的效应，而几乎没有探索其隔离蛋白的过程。环状RNA和蛋白在这种模式下具体发生了什么变化我们还知之甚少。
（3） 募集蛋白到染色质
在这一部分中，环状RNA与顺式元件结合，调控转录因子或表观遗传，从而改变基因表达。我们将之分为三类：转录因子、DNA或组蛋白修饰酶和染色质重塑因子。
①：转录因子
环状RNA可将转录因子招募到启动子区。CircRHOT1可招募TIP60到NR2F6启动子来激活转录，从而抑制肝细胞癌的增殖、迁移和侵袭。此外，CircAnks1a可招募YBX1到VEGFB启动子并激活转录，VEGFB的升高可以改善神经损伤后的疼痛行为及神经元兴奋性。Circ0005276和CircPOK也属于这一类。
②：修饰酶
至于表观遗传，环状RNA可以募集修饰酶到DNA（甲基化）或组蛋白（甲基化和乙酰化），以改变染色质的可及性，从而开启或关闭基因表达。CircFECR1通过招募TET1到FLI1的启动子，诱导DNA去甲基化和转录激活，从而增强乳腺癌的侵袭。此外，CircMRPS35可将KAT7招募到FOXO1/3a启动子，引起H4K5乙酰化，从而抑制胃癌的增殖和侵袭。相反，CircAGFG1和CircLRP6均可招募EZH2到靶基因启动子，诱导甲基化并抑制转录。
③：染色质重塑因子
此外，环状RNA还可以招募重塑复合体到染色质以调控转录。例如CircDONSON与 CircKcnt2。转录因子和三维基因组之间的相互作用决定细胞命运，明确环状RNA如何塑造染色质及其和转录组之间的关系十分有意义。
（4） 形成环状RNA-蛋白-mRNA三元复合体
三元复合体在环状RNA-蛋白相互作用中很常见，第一和第三部分分别提到了环状RNA-蛋白A/B和环状RNA-蛋白-染色质复合体。这一部分将重点介绍环状RNA-蛋白质-mRNA三元复合体，它们可以调控mRNA的稳定性，或直接调控翻译。
①：调控稳定性
环状RNA促进RNA结合蛋白与mRNA结合，从而稳定mRNA并增加翻译。例如CircNSUN2与IGF2BP2和HMGA2 mRNA结合，随后HMGA2上调并诱导EMT，促进结直肠癌的侵袭。此外，CircPOK与ILF2/3复合体相互作用，稳定了IL-6和VEGF mRNA；同样地，CircFNDC3B-IGF2BP3-CD44mRNA三元复合体可稳定CD44的mRNA。
②：调控翻译
这种情况则更有趣。一项研究描述了环状RNA嵌入mRNA和核糖体之间，起到刹车的作用，阻碍翻译。CircMalat1分别通过11个互补碱基和IRES与PAX5 mRNA和核糖体结合，导致翻译中断。另一项研究则描述了一种干扰翻译起始的机制。CircYap不仅与其线性转录本Yap mRNA结合，还与eIF4G和PABP结合。这个四聚体阻碍了PABP和eIF4G的互作，从而阻止YAP的翻译起始。相反，CircMYBL2可通过增强PTBP1和FLT3 mRNA的互作而促进翻译。由第三和第四部分可知，环状RNA在转录/表观遗传和翻译水平上都发挥着调控作用。然而，环状RNA-蛋白-核酸三元复合体的确切结构以及组装、连接和解离的过程尚未被完全解析。
（5） 蛋白转位或重分布
最常见的胞内运输事件发生在核质之间。在这一部分中，根据环状RNA定位和蛋白再分布，我们将其分为四类（图3）。
①：增加核分布
CircAmotl1促进乳腺癌增殖和侵袭，抑制细胞凋亡。机制上，它直接与c-myc结合并将其滞留于核，进而增加c-myc下游基因的表达。CircAmotl1促进STAT3入核。核STAT3与DNMT3a启动子结合并激活转录，而DNMT3A可使miR-17启动子甲基化，从而上调miR-17-5p的靶点，包括纤连蛋白、DNMT3a和STAT3。这些因素构成正反馈环，促进成纤维细胞的增殖、存活、黏附和迁移，加速伤口修复。CircDNMT1，CircABCC1，CircSOX4也类似于此。
②：增加胞质分布
CircFoxo3过表达可诱导心脏衰老，加重阿霉素诱导的心肌病。机制上其可将ID-1、E2F1、FAK和HIF-1α滞留在胞质中，从而损害这些主要在核内发挥作用的转录因子的功能。此外，CircFOXP1，CircSTAG1，CircBACH1和CircZFP609也属于此类。最近的一项研究表明，CircCCAC1可被胆管癌细胞分泌，经外泌体运送至单层内皮细胞，破坏屏障完整，增强血管生成。机制上，CircCCAC1将EZH2滞留在胞质中，使得SH3GL2启动子去甲基化。随后，细胞连接蛋白减少，通透性增加。
③：其他区域
除此之外，三项研究分别表明，环状RNA还可以将蛋白运输到核仁（CircERBB2）、细胞膜（CircSKA3）和线粒体（mecciND1和mecciND5）。综上所述，蛋白再分布通常伴随着活性增强或抑制，靠近或远离靶点，从而导致功能增强或抑制，以及相应的下游变化。然而，蛋白运输和环状RNA本身的运输之间的关系还没有被研究过。
（6） 总结
需要强调的是，五种模式并不是严格互斥，而是存在重叠的。我们主要根据研究中所强调的效应来分类。另外值得考虑的是环状RNA的功能与其母基因之间的相关性。与蛋白互作极大丰富了环状RNA的功能，虽然目前这些研究涉及的领域广泛，但却无特定规律。
展望
尽管环状RNA-蛋白相互作用的领域已取得了丰硕成果，但由理论缺陷和技术限制带来的挑战和困难依然存在。例如，何种因素决定了环状RNA是作为支架还是陷阱（支持或妨碍）蛋白？何种因素引起几个特定分子形成复合体？是否存在其他分子（如代谢物和离子）与环状RNA互作？环状RNA是否参与蛋白进出其他细胞器（如内质网、高尔基体和溶酶体）、亚细胞区室或胞外空间？如何研究定位于其他细胞器中的环状RNA？如何分析环状RNA-蛋白复合体的确切结构？如何捕捉活实时和动态的环状RNA与蛋白互作？
目前，关于环状RNA与蛋白相互作用的研究还处于初步阶段，尽管它们是理想的诊断标志物和治疗靶点，但遗憾的是，尚无基于环状RNA的临床应用获批。然而，我们提到的一些研究已经显示出非常有前景的成就。例如，环状RNA SCAR的研究设计了一种靶向线粒体的纳米颗粒平台，可将包裹环状RNA的载体运送到线粒体。CircPan3、cia-cGAS和CircKcnt2的研究则通过CRISPR/Cas9技术针对环状RNA侧翼内含子中的ICS构建了环状RNA敲除鼠，并避免影响其相应的母基因。环状RNA-蛋白互作改变了蛋白，从而可以调控生命活动，这激励我们去设计基于（干扰或利用）其相互作用的全新临床策略。