9月10日,Cell Death & Disease杂志(IF=5.959,中科院JCR二区)在线发表一篇题为“High throughput circRNA sequencing analysis reveals novel insights into the mechanism of nitidine chloride against hepatocellular carcinoma”的研究论文。该文章的通讯作者为广西医科大学的罗殿中教授和陈罡教授。

简介

氯化两面针碱(NC)在肝细胞癌(HCC)中具有抗癌作用。然而,NC对肝细胞癌的作用机制仍然很不清楚。该研究通过对氯化二硝基(NC)处理和未处理的肝细胞癌(肝细胞癌)异种移植肿瘤组织进行高通量circRNAs测序,共鉴定297个差异表达circRNAs,并通过定量PCR验证hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049。体外实验表明,hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049可以抑制肝细胞癌的恶性生物学行为,表明它们可能在肝细胞癌的发展中起重要作用。为了阐明两个circRNAs是否在肝细胞癌中起miRNA海绵作用,作者分别使用CircInteractome和miRwalk鉴定了circRNA-miRNA和miRNA-mRNA的相互作用。随后,选择857个与miRNAs相关的肝细胞癌中差异表达的基因用于加权基因共表达网络分析(WGCNA),发现绿松石模块的423个基因与肝细胞癌患者的存活时间,病理分级和TNM分期显著相关。基因功能富集分析显示,423个基因主要在DNA复制和细胞周期相关的生物过程和信号级联中起作用。然后鉴定了与肝细胞癌患者的临床结果相关的18个节点基因(SMARCD1,CBX1,HCFC1,RBM12B,RCC2,NUP205,ECT2,PRIM2,RBM28,COPS7B,PRRC2A,GPR107,ANKRD52,TUBA1B,ATXN7L3,FUS,MCM8和RACGAP1)。这些发现表明,hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049与其竞争的mRNA之间的交联可能在肝细胞癌中发挥重要作用,可能作为肝细胞癌中NC的治疗靶标。

NC在体外抑制增殖并诱导肝细胞癌细胞凋亡

为了阐明NC对肝细胞癌细胞增殖的抑制作用,作者进行了细胞计数试剂盒-8(CCK8)测定,发现NC引起SMMC7721和Huh7细胞生长时间和剂量依赖性降低。 细胞周期分析显示24小时NC处理以剂量依赖性方式诱导SMMC7721和Huh7细胞中的G2 / M期阻滞,表明NC通过G2 / M期阻滞抑制细胞生长。为了确定NC是否可以在肝细胞癌细胞中诱导细胞凋亡,作者对用不同浓度的NC处理后24和48 h的SMMC7721和Huh7细胞进行流式细胞分析,结果显示NC促进肝细胞癌细胞的晚期凋亡。

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图1 NC抑制肝细胞癌的细胞活力并诱导细胞凋亡

NC在体外抑制肝细胞癌细胞的迁移

为了确定NC对肝细胞癌细胞迁移的影响,作者进行了伤口愈合实验,发现NC处理以时间和剂量依赖性方式抑制SMMC7721和Huh7细胞的迁移。

图2 NC抑制HCC细胞的迁移

基于RNA-seq分析和RT-qPCR的差异表达的circRNAs

为了研究circRNAs在NC抑制肝细胞癌细胞凋亡和迁移过程的作用,收集三对NC处理和未处理的肝细胞癌异种移植肿瘤组织用于circRNAs的RNA-seq分析。结果共鉴定了297个差异表达的circRNAs,其中188个上调,109个下调。挑选三个circRNAs(hsa_circ_0088364,hsa_circ_0090049和hsa_circ_0102434)在异种移植肿瘤细胞中进行qRT-PCR验证,发现hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049的表达变化与RNA-seq结果一致。另外,使用经NC处理或未经NC处理的细胞系SMMC7721和Huh7,证实了NC对hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049表达的剂量依赖性抑制作用,表明两个circRNAs可能是NC的靶标。

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图3 NC处理的差异表达circRNAs

hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049在肝细胞癌中的生物学效应

为了研究hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049在肝细胞癌中的生物学效应,作者进行了qRT-PCR实验,发现hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049在SMMC7721和Huh7细胞中的表达高于正常肝细胞LO2,表明它们可能作为肿瘤促进circRNAs。然后,作者用慢病毒在SMMC7721和Huh7中过表达这两个circRNAs(图4c,d)进行体外实验。CCK8实验表明hsa_circ_0090049促进SMMC7721和Huh7细胞的增殖,而hsa_circ_0088364对HCC细胞的增殖没有影响。与此一致,hsa_circ_0090049可以促进HCC细胞进入G1期,而hsa_circ_0088364对细胞周期没有影响。随后,作者分别用3μmol/ L和10μmol/ L NC处理SMMC7721和Huh7细胞24 h,发现hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049的高表达抑制NC诱导的细胞凋亡。

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图4 hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049对HCC细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的生物学效应

此外,作者使用伤口愈合试验来探究hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049是否影响肝细胞癌细胞迁移。结果显示,hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049促进了SMMC7721和Huh7细胞的迁移。

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图5 hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049对HCC细胞迁移的生物学效应。

鉴定circRNA-miRNA和miRNA-mRNA相互作用

越来越多的研究报道,circRNA作为miRNA海绵在许多人类疾病中发挥作用,包括恶性肿瘤。在这个研究中,作者用CircInteractome预测hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049的miRNA结合位点,结果,hsa_circ_0088364包含15个miRNA结合位点,hsa_circ_0090049包含4个miRNA结合位点,其中两者都包含miR-548c-3p的结合位点。

根据| log2(foldchange)| > 0.585和调整p值< 0.05,从癌症基因组图谱(TCGA)中获得4995个差异表达基因,包括3154个上调基因和1841个下调基因。 同时,从miRWalk获得3018个经实验验证的17个miRNA(不包含miR-1273)的靶标mRNA,并与4995个差异表达基因相交。 最后,确定了肝细胞癌中857个与miRNA相关的差异表达基因。

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图6 鉴定circRNA-miRNA和miRNA-mRNA相互作用

检测临床上显著的基因共表达模块

作者对HCC中857个miRNA相关的差异表达基因进行WGCNA分析,MEturquoise模块(423个基因)与肝细胞癌患者的存活时间、病理学分级和TNM分期显著相关。此外,MEturquoise中的模块成员与生存、病理分级和TNM分期的基因显著相关。因此,随后的研究集中在具有临床意义的Meturquoise模块。

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图7 通过WGCNA分析鉴定与肝细胞癌(HCC)临床特征相关的模块

随后作者对MEturquoise中的423个基因进行GO注释,发现这些基因主要与“DNA复制”、“染色体区域”和“核心启动子结合”有关。KEGG分析表明这些基因与“细胞周期”、“p53信号传导途径”等肿瘤相关的信号级联有关。

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图8 METurquoise中423个基因的GO功能注释和KEGG分析

circRNA-miRNA-mRNA网络的构建

选择MEturquoise中的423个基因用于circRNA-miRNA-mRNA网络构建。在整合circRNA-miRNA相互作用和miRNA-mRNA相互作用后,构建了由两个circRNA(hsa_circ_0088364和hsa_circ_0090049),17个miRNA和423个mRNA组成的网络。

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图9 circRNA-miRNA-mRNA网络图

在MEturquoise中鉴定和验证与生存相关的枢纽基因

对于MEturquoise中的423个基因,作者确定18个hubgenes基因(SMARCD1,CBX1,HCFC1,RBM12B,RCC2,NUP205,ECT2,PRIM2,RBM28,COPS7B,PRRC2A,GPR107,ANKRD52,TUBA1B,ATXN7L3,FUS,MCM8和RACGAP1)。这18个基因与MEturquoise高度相关(MM> 0.8),并且与肝细胞癌患者的生存时间、病理分级和TNM分期显著相关。根据TCGA的数据,所有这18个基因在HCC中上调。Univariate Cox分析显示,除了PRRC2A之外,hubgenes的高表达表明肝细胞癌患者的总体存活率较差。来自Kaplan–Meier plotter的364个RNA-seq数据证实了hubgenes表达与HCC患者的存活率之间的关系。RBM12B和FUS与364例肝细胞癌患者的存活率无关,但其余15个基因的高表达表明存活率较差。此外,这些hubgenes的表达与肝细胞癌患者的无复发生存(RFS)和无进展生存(PFS)之间的关联也分别通过来自Kaplan–Meier plotter的316和370个 RNA-seq数据进行了验证。

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图10 鉴定MEturquoise中的18个hubgenes

参考文献:

Xiong, D. D., Feng, Z. B., Lai, Z., et al. 2019. High throughput circRNA sequencing analysis reveals novel insights into the mechanism of nitidine chloride against hepatocellular carcinoma. Cell Death & Disease. https://doi.org/10.1038/s41419-019-1890-9

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