环状RNA（circRNA）凭借其独特的共价闭合环状结构，相较于传统线性mRNA具有更高的稳定性和更持久的蛋白表达潜力，在RNA药物及疫苗研发领域展现出良好的应用前景。然而，目前脂质纳米颗粒（LNP）递送系统的研究主要集中于线性RNA，而circRNA在分子拓扑结构及理化性质方面与线性RNA存在差异，针对其特点的递送载体开发仍相对有限。因此，开发适用于circRNA的新型递送材料，明确影响其递送效率的关键结构因素，对于推动circRNA药物的进一步发展具有重要意义。
近日，美国斯坦福大学Paul A. Wender教授团队在Journal of the American Chemical Society（JACS）发表了题为“Circular RNA Delivery In Vitro and In Vivo Using Doubly Branched Aminoethoxy-Functionalized Ionizable Lipid Nanoparticles”的研究论文。
该研究通过模块化合成策略，对可离子化脂质的疏水尾链、连接臂及头基结构进行优化，开发了一类用于circRNA递送的新型双分支氨基乙氧基功能化可离子化脂质。其中，代表性脂质iL-19介导的circRNA报告蛋白表达水平在C2C12成肌细胞中达到SM-102配方的约28倍，在小鼠肌肉注射模型中达到约2.5倍。研究结果揭示了影响circRNA递送性能的关键脂质结构特征，为新型circRNA递送载体的设计与优化提供了参考。
可离子化脂质的模块化合成与脂质库构建
现有可离子化脂质主要针对线性RNA递送进行优化，而circRNA在分子拓扑结构及理化性质方面与线性RNA存在差异。为改善circRNA的递送性能，研究团队设计了一类新型可离子化脂质。
研究团队开发了一种以商业可得的氨基醇为原料的模块化两步合成方法，通过SN2烷基化及酰化反应引入疏水尾链、可生物降解酯键和可离子化头基。经条件优化，目标产物3的分离收率达到79%，两步总收率超过70%。基于该方法，研究人员通过调整疏水尾链、连接臂及头基结构，构建了包含19种新型可离子化脂质的第一代化合物库。
随后，研究团队制备了包封萤火虫荧光素酶环状RNA（circLuc）的LNP。理化性质表征显示，LNP粒径均小于200 nm，RNA包封率超过80%，且在4 ℃储存14天期间主要胶体性质未发生明显变化。
在C2C12成肌细胞及HEK 293T细胞中的递送实验显示，两种细胞系呈现出一致的结构–递送性能关系（SDRs）。其中，具有双分支疏水尾链的iL-5和iL-7表现出较高的蛋白表达水平，含9–11个碳原子的疏水尾链表现较优。此外，在头基或连接臂中引入2-氨基乙氧基单元可提高circRNA介导的蛋白表达，而硅烷基团的引入未改善递送效果。
图1. 用于LNP介导的RNA递送的可离子化脂质及辅助脂质。
图2. 第一代可离子化脂质的合成路线、化学结构及其介导的circLuc在C2C12成肌细胞中的相对生物发光强度（递送后12 h）。
第二代可离子化脂质的优化与体外递送
基于第一代脂质的筛选结果，研究团队将双分支疏水尾链与不同数量的2-氨基乙氧基单元引入三胺骨架，合成了6种第二代可离子化脂质（iL-15–iL-20）。体外实验显示，6种脂质在C2C12成肌细胞中递送circLuc后的生物发光强度均超过SM-102的10倍（P＜0.0001）。其中，iL-19和iL-20介导的蛋白表达水平约为SM-102的28倍，相应LNP粒径约为130 nm，PDI低于0.3，RNA包封率超过90%，表观pKa为6.7–6.8。
图3. 第二代可离子化脂质的化学结构及其LNP体外递送circLuc后C2C12细胞的相对生物发光强度（递送后12 h）。
circRNA递送性能的体内验证
为验证体外筛选获得的结构特征在体内的适用性，研究团队采用雌性BALB/c小鼠肌肉注射模型，于给药12 h后检测circLuc介导的蛋白表达。体内实验结果显示，双分支异戊二烯型疏水尾链及2-氨基乙氧基单元同样有利于提高circRNA介导的蛋白表达水平。其中，iL-19介导的蛋白表达水平约为SM-102的2.5倍，分别为ALC-0315、DLin-MC3-DMA和δO3的7.8倍、33.4倍和2.3倍。实验期间未观察到明显急性毒性反应，但仍需进一步开展安全性及免疫原性等研究。初步静脉注射实验显示，iL-19与SM-102的递送效果相近，且均呈现肝脏定位特征。
图4. BALB/c小鼠后肢肌肉注射circLuc-LNP后的相对体内生物发光强度。
总结
本研究通过系统的结构–递送性能关系分析，发现双分支异戊二烯型疏水尾链、三胺骨架及2-氨基乙氧基单元是影响circRNA递送性能的重要结构因素，并在小鼠肌肉注射模型中验证了相关结构特征对蛋白表达的影响。该研究为circRNA递送载体的结构设计提供了参考，但其递送效率提升的具体机制、安全性、免疫原性及药代动力学特征仍需进一步研究。
原文链接：
https://pubs.acs.org/jacsat/article-abstract/doi/10.1021/jacs.6c14175/5448503/Circular-RNA-Delivery-In-Vitro-and-In-Vivo-Using?redirectedFrom=fulltext