概述

2023年7月13日，OncoRNALab联合了众多国际知名环状RNA研究大咖在Nature Methods(IF=48.0)刊发了Large-scale benchmarking of circRNA detection tools reveals large differences in sensitivity but not in precision，研究团队对二代测序环状RNA检测工具进行了标准化测试。
OncoRNALab由比利时根特大学的Jo Vandesompele和Pieter Mestdagh教授负责监管，属于根特医学遗传学中心和癌症研究所的一部分。该实验室的研究旨在利用RNA进行诊断和治疗，目前大量研究集中于非编码RNA在癌症中的作用以及细胞外RNA在液体活检中的应用。该实验室试图通过高通量测序技术与生物信息学工具的结合来回答各种基础和转化研究的问题。

 

这篇文章很短，但是故事很长。

文章很短，文章只做了一件环状RNA研究者都会做的事：对高通量测序检测到的环状RNA进行低通量验证。

故事很长，本文联合了环状RNA领域的诸多大咖一起，通过3种低通量检测方法对16个高通量circRNA检测方法的精确性和敏感性等指标进行了评估。而这16个工具，来自不同的时间、不同的研究小组，见证了环状RNA领域的发展史；每一个工具的背后应该都有一段故事——叙说了开发者对环状RNA的认知和期许。

文章对3种人类癌症细胞系的total RNA进行了深度测序，通过16种知名的检测工具识别到了315312个环状RNA，随后通过三种正交的低通量验证方法：

qPCR

确定候选circRNA BSJ是否能够被检测到。

RNase R

证实所检测到的RNA是环状的而不是线性的。

amplicon sequencing

即PCR扩增后sanger测序，用于证实环状RNA BSJ序列对1516个预测的circRNAs进行了验证。结果显示，16种工具的准确性中值达到了98.8%、96.3%和95.5%，然而这些工具的敏感性和预测数量差异巨大。

评估过程与部分结果

文章的发起者让16个工具对应的作者团队利用自己的工具对3个深度测序的细胞系进行环状RNA预测（如下图）。随后，每个工具随机挑选80个BSJ counts>=5以及20个BSJ counts<5共100个环状RNA——总共1600个环状RNA用于验证。

一些环状RNA引物存在脱靶风险，将不被考虑用于验证，剩余1560个分子。

同时由于偶然原因，不同的工具，不同的细胞系，相同的circRNA被选中，最后1516个circRNAs被用于最后的验证。

每个工具具体的环状RNA精确性（验证率）如下图

敏感性评估如下图

敏感性和精确性的综合评估

更详细的结果请访问原文：
https://doi.org/10.1038/s41592-023-01944-6

小知识

中肯的建议

该项研究表明，3种验证方法都有各自的优势和偏差，也有一些环状RNA验证结果存在冲突（如下图）。
因此，作者表明
单纯的qPCR验证是不足够的；
qPCR+RNase R组合是OK的；
qPCR+amplicon sequencing更好。
当然，我们可以看到大部分文章，3种验证方法都开展了。
对于高通量环状RNA筛选工具，多个工具得到的交集可能有更高的概率被验证；然而，这种方式仍然无法避免假阳性结果的发生（如下图）。另外，文章也给出了一些工具的组合供研究者参考（文章附表7-9）。

表格链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-023-01944-6#MOESM4
文章作者给出了中肯的建议以供环状RNA研究者作为参考（如下表）。
同时，文章中检测以及验证的环状RNA都可以在github上获取到，地址为：

https://github.com/OncoRNALab/circRNA_benchmarking
以下是参与该研究的部分国内大咖清单
• 南京中医药大学，顾万君• 武汉大学，何春江

• 东南大学，温国霞

• 浙江大学，叶楚玉

• 复旦大学，杨力

• 上海中科院，袁国华

• 北京中科院，赵方庆

• 台湾中央研究院，莊樹諄

分类： circRNA与疾病, circRNA生物学, circRNA研究常用数据库与小工具, 前沿动态, 实用工具, 最新重要进展, 每周进展汇总, 研究热点跟踪评论

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